叶绿体核糖体蛋白PSRP-1部分cDNA序列的克隆

【摘要】： 在高等植物的叶绿体中，叶绿体核糖体合成了组成4种能量传递复合物的30种蛋白质、约20种核糖体蛋白及核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶等含量丰富的蛋白质，在叶绿体的蛋白质代谢中具有重要地位。几种叶绿体特有的核糖体蛋白质(PSRP)被认为参与了叶绿体基因表达在翻译水平的调控。PSRP-1(S30／S22)是由核基因组编码的叶绿体核糖体特有的蛋白，组成叶绿体核糖体的30S小亚基。通过构建并筛选cDNA文库可以克隆编码PSRP-1的基因，从而进一步研究它在叶绿体核糖体组成、翻译起始及其在基因转录后调控中的功能。 利用CLONTECH公司的cDNA文库构建试剂盒(SMART~(TM) cDNA Library Construction Kit)构建了桂竹香、白菜型油菜、芥蓝、诸葛菜和羽衣甘蓝五种十字花科植物的cDNA文库。所构建的白菜型油菜cDNA文库滴度为1.02×10~6pfu／ml，重组率为82％；利用PCR方法扩增白菜型油菜cDNA文库的插入片段，其长度在500bp～1.5kb之间。桂竹香cDNA文库的滴度为5.72×10~5pfu／ml。在桂竹香平板上随机挑取了7个噬菌斑，分别用噬菌体感染E. coli BM25.8。将噬菌体DNA转变为质粒后，提取质粒，用SfiⅠ酶切检查插入片段，其中有4种质粒含有插入片段，长度在500bp～1.0kb之间。分别将五种植物的cDNA文库进行扩增，扩增后的cDNA文库保存在-70℃。 实验室保存的探针用地高辛系统标记后，进行原位杂交筛选cDNA文库。从桂竹香cDNA文库中经初筛得到12个阳性克隆。再经过第二次筛选，得到一个阳性克隆。将所得到的阳性克隆测序，发现其中的插入片段长506bp。利用BLASTn和BLASTp在GENEBANK数据库中寻找同源序列。该插入片段编码一段含有99个氨基酸残基的多肽，其核苷酸序列分别与菠菜Psrp-1基因的部分序列具有68％的一致性， 与拟南芥中可能编码530蛋白的序列具有91%的一致性;由核普酸序 列推导的蛋白质序列与菠菜PSRP一具有同源性。从桂竹香中克隆到 的这一片段可能是编码桂竹香PSRP吸蛋白梭基端的部分cDNA序列。 利用地高辛标记的探针筛选白菜性油菜CDNA文库，没有得到与编 码PSRP一1蛋白的cDNA序列具有同源性的克隆。