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人抗菌多肽的分离纯化、鉴定、cDNA克隆、基因重组及其结构与功能研究

杨华蓉  
【摘要】: 细菌对传统抗生素的耐药问题成为临床医学中急需解决的难题,开发新的抗菌药物已经成为迫在眉睫的重要任务。人淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)中存在多种具有杀菌作用的活性物质,已经在LAK细胞中发现了穿孔素、颗粒酶、颗粒溶素、LL-37、α-防御素等抗菌分子。LAK细胞中是否还有其它内源性抗菌肽尚不清楚。 子宫颈粘液具强大抗细菌穿透能力,溶菌酶的含量不足以行使其强大抗菌效力,可能存在其它抗菌分子。 我们将rIL-2、PHA刺激培养一周的人外周血单个核淋巴细胞(人LAK细胞)用5%的乙酸电动匀浆,制备酸溶性粗提物。AU-PAGE电泳及电泳凝胶琼脂糖弥散法检测出人LAK细胞酸溶性粗提物中含有三组杀菌多肽成分,分别命名为HLP-1、HLP-2、HLP-3三个组分,利用制备性AU-PAGE电泳技术初步分离获得这三个组分。再将这三个组分用反向高效液相色谱技术进一步分离纯化,收集洗脱液、冻干获得过柱后各组分。琼脂糖弥散法筛选经RP-HPLC纯化的各组分的抗菌活性,较强抗菌活性的组分进行Tricine-SDS-PAGE电泳初步测 摘要 定其分子量及纯度。选择纯度大于95%的蛋白组分HLP一3P21进行电 泳并电转移至PVDF膜上,采取Edman降解法测定其氮端氨基酸序 列。结果我们得到HLP一3P21的N一端10个氨基酸的序列为脯氨酸(Pro, p),赖氨酸(Lys,K),精氨酸(为g,R),赖氨酸(Lys,K),丙氨 酸(Ala,A),谷氨酸(Glu,E),甘氨酸(GI叭G),天冬氨酸(Asp,D) 丙氨酸(Ala,A),赖氨酸(Lys,K)。将该段氨基酸序列登录美国国 立医学图书馆(NCBI),应用Blast检索工具进行短序列匹配的人蛋 白质数据库检索发现:与该序列100%同源的蛋白质共有9个,其中 一个为已知人非组蛋白HMG一17,四个为HMG一17的类似物,另四个 为由人mRNA序列推导的理论蛋白。为鉴定抗菌活性组分HLP一3P21 究竟为何种蛋白,我们以氨基酸序列PKRKAEGDAK对应的碱基序 列CCC AAG AGA AAG GCT GAA GGG GAT GCT AAG为模板设计 5,端特异引物AGA AAG GCT GAA GGG GAT GC进行3‘raee一PCR 扩增出其3’端序列,结果得到了11oobp、750bp、50obp三个不同大 小的片段,分别连接至T载体转化感受态细胞后,挑选阳性菌落进行 核酸测序,再将相应序列登录NCBI的人mRNA数据库分别检索出 11oobp、750bp、50obP片段所对应的基因序列及其所编码的蛋白质氨 基酸序列,并将结果与我们所得到的HLP一3PZI的N一端氨基酸序列及 碱基序列进行比较,结果发现仅1 100bp及其对应的N一端氨基酸序列 与HLP一3PZI完全匹配,500bp及750bp的片段均为非特异性扩增, 摘要 不能匹配,所以我们能够确定1100bp对应的基因就是编码HLP一3PZI 的基因,而这段基因所编码的蛋白质就是HMG一17,基于上述生物信 息学的分析鉴定出我们分离纯化的抗菌活性分子就是HMG一17。 从人宫颈粘液酸溶性提取物中按上述方法亦分离纯化出了一个 抗菌分子HCP,在理化特性及抗菌活性上与前者均有很大的相似性: 分子量相近、HPLC出峰时间相同、均只对革兰氏阴性菌有抗菌活性。 但因获得的量很少,未能获得N一端氨基酸序列资料。 将HMG一17进行蛋白质亲疏水性、a一跨膜螺旋结构的分析,找到 其疏水区及a一跨膜螺旋结构主要位于17一47氨基酸残基区域,而这一 段结构域同时也是HMG一17分子的DNA结合区,并且在各种物种中 具有高度保守性。因为。一跨膜螺旋结构在抗菌肤分子的杀菌效应中有 重要作用,所以我们分别构建了HMG一17及HMG一17。一跨膜螺旋结构 域(下面简称HMG一17a)的原核表达质粒PGEX一IT一HMG17及 PGEX一IT一HMG17Q,转化大肠杆菌,进行融合表达。融合表达的蛋 白质经亲和层析纯化后,用凝血酶酶切,再经AU一PAGE电泳分离分 别得到纯化的HMG一17和HMG一17Q。选用大肠杆菌氨节青霉素耐药 株ML一35p及绿脓杆菌标准株ATCC65922,测定HMG一17和HMG一17 Q的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC),比较二者的抗 菌活性,结果证实HMG一1 7Q是HMG一17抗菌活性的重要功能区。


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