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用PCR定点突变方法研究人抗菌肽FALL-39结构与功能的关系

杨云霞  
【摘要】: 目的:构建人抗菌肽FALL-39的原核表达系统,解决抗菌肽获取困难的难题;用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体,并比较研究FALL-39及其突变肽的功能。方法:应用RT-PCR从人肺腺上皮细胞株SPC-A-1总RNA中扩增FALL-39成熟肽cDNA,以pGEX-1λT为载体,构建抗菌肽FALL-39基因大肠杆菌表达载体;采用一步法和两步法PCR体外定点突变技术,用赖氨酸替代第24位的谷氨酰胺和/或第32位的天门冬氨酸,构建FALL-39突变体大肠杆菌表达载体;该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切、胶回收和高效液相色谱分离纯化,获得高度纯化的重组FALL-39以及突变肽;对纯化产物进行的MEC、MIC、MBC和溶血性实验等比较抗菌作用以及对红细胞膜的溶解性,用RT-PCR测定人单核巨噬细胞株THP-1 iNOS的表达,研究FALL-39及其突变肽的抗内毒作用。结果:重组质粒pGEX-1λT-FALL-39测序结果说明其插入片段序列与GenBank登录的FALL-39基因的cDNA序列相符,且插入方向正确;DNA测序结果表明在预期位点发生突变,用一步法得到突变体质粒pGEX-1λT-FALL-39-Lys32,用两步法得到pGEX-1λT-FALL-39-Lys24以及pGEX-1λT-FALL-39-Lys24'32;重组原核表达质粒pGEX-1λT-FALL-39及其突变体融合蛋白有高效表达,经提取纯化可得到高纯度的活性蛋白FALL-39,FALL-39-Lys24,FALL-39-Lys32和 用PCR定点突变方法研究人抗菌肤FALL一39功能与结构的关系----一中文摘要 FALL一39一切524’32(约4Kd)。突变后的FALL一39蛋白对大肠杆菌ATcc 25922和耐氨节青霉素ML一35P的抗菌活性明显增强,最低抑菌浓度 (Mle)和最低杀菌浓度(MBe)值FALL一39一切524,32最小,其次是 FALL一39一Lys32和FALL一39一Lys24,均小于FALL一39。FALL一39一切532 和FALL一39两种蛋白均在含MediumE的LB培养基中表现出较高活性, 在LB培养基中抗菌活性最低,但在同一种培养基中FALL一39一Lys32蛋 白抗菌活性要高于FALL一39蛋白。突变后FALL一39蛋白在抗菌剂量时 对红细胞的溶解作用未见明显增加,较大剂量时对红细胞的溶解作用略 有增加。突变后FALL一39一Lys32蛋白对LPS引起的iNOS mRNA的表 达量增强抑制作用明显。结论:用FALL一39基因大肠杆菌表达载体可 得到高效表达的蛋白;用高保真的Polybest DNA多聚酶进行一步法 PCR定点突变技术简单、有效;突变质粒表达分子的抗菌活性和抗内 毒素明显增强,对红细胞的溶解作用在抗菌剂量时未见明显增加,较大 剂量时略有增加,提示在FALL一39分子中增加碱性氨基酸可以增强其 抗菌活性。


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