收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

可示踪的防龋基因疫苗构建、表达及其基因疫苗PELA微球的研究

刘莉  
【摘要】: 本研究将微生物学、免疫学、分子生物学和生物材料学等多学科有机结合起来,运用基因重组技术构建了可示踪的防龋基因疫苗;对可生物降解材料作为防龋基因疫苗释放系统进行了研究;并对防龋基因疫苗在体内外的表达以及不同方式免疫的BALB/C小鼠的特异性抗体进行了检测。通过GFP的指示作用及免疫组化方法,对防龋基因疫苗在体内外的表达进行初步的示踪研究,为防龋基因疫苗的临床应用奠定基础。本研究共包括四个部分。 第一,本研究构建了以绿荧光蛋白基因作为报告基因的可示踪的防龋基因疫苗。利用PCR方法,扩增变异链球菌(Streptococci mutans,S.mutans)MT8148菌株表面蛋白抗原PAC氨基端的基因片段pac-A(1.3Kb)。PCR产物与真核表达质粒pEGFP-C1双酶切,并回收相应DNA片段后,采用DNA连接试剂盒进行连接重组,转化。转化子中的重组质粒经双酶切鉴定,获得了4.7Kb与1.3Kb两个片段;重组质粒中插入基因的序列测定表明,该插入序列与pac全基因的314-1630bp的核酸序列完全相同,插入基因的两侧分别与Kpn Ⅰ和Apa Ⅰ酶切位点的序列一致,插入基因的上游有起始密码子,下游有终止密码子。以上结果均证实该重组质粒构建正确,目的基因pac-A定向插入至真核表达载体中,未改变目的基因的阅读框架。我们将此重组质粒命名为pEGFPC1-pacA。该重组质粒的成功构建为下一步实验的顺利进行提供了可靠的保障。 第二,为了检测构建的可示踪的防龋基因疫苗能否在哺乳动物细胞中正 博士学位论文一摘要 确表达出来,将构建正确的重组质粒pEGFPCI一pacA采用脂质体Lipofectin 试剂介导转染COSI细胞。通过荧光倒置显微镜直接观察和流式细胞仪测定 荧光强度指示GFP的表达;采用RT一PCR法检测重组质粒中那c叨基因在COSI 细胞中的转录;并用蛋白质免疫印迹杂交(Western blot)检测转染细胞上 清液pac一基因的表达。结果在荧光显微镜下观察到了发绿色荧光的Cosl 细胞,重组质粒组细胞的平均荧光强度高于阴性对照细胞组,表明重组质粒 能正确表达出绿荧光蛋白;RT一PCR扩增获得了1,3Kb的片段;表达产物的 Western blot结果显示,在分子量为56 KD与89 KD处有两条杂交阳性带, 其分子量分别与pa酬基因表达产物与Pac胡下了力融合基因表达产物的推算 值相符,表明重组质粒中pac一与g巾基因能正确表达并可分泌至胞外,而 且能与特异性抗体结合,具有免疫学生物活性。上述结果表明,构建的可示 踪的防龋基因疫苗能在哺乳动物细胞中正确表达出来,报告基因g动与目 的基因pa酬在哺乳动物细胞中具有转录和翻译活性及其相应的生物学活性, 这为可示踪的防龋基因疫苗的动物体内实验提供了良好的材料。 第三,本实验旨在为防龋基因疫苗寻找一种有效的释放系统。以聚乳酸 一聚乙二醇共聚物(PELA)为材料,采用改进的溶剂挥发法双乳液(Wl/o/W2) 体系制备DN刀PELA复合物,在扫描电镜下观察其形态、粒度分布仪测定 平均粒径;测定了复合物中DNA的包封率、细胞外释放特征,及其包被对 DNA结构的影响;采用MTT法测定了PELA包被材料本身的细胞毒性;并 对其介导的DNA体外转染真核细胞的效果进行了检测。结果显示所制备的 复合物多为球形,平均粒径1.806腼;微球中DNA的包封率达78.9%,在细 胞外具有缓释的特征,DNA结构没有被破坏;PELA材料本身对细胞基本无 毒性;DN户JPELA微球能在体外直接转染COsl细胞,在荧光倒置显微镜下 观察到了发绿色荧光的被转染细胞:流式细胞仪测定重组质粒DN刀PELA 微球细胞组的平均荧光强度比阴性对照细胞组的高,但比阳性对照细胞组 低;用RT一PcR检测重组质粒阳性对照组及DN刀PELA转染组的pac一基因 的转录,结果显示,重组质粒阳性对照组细胞和DNA/PELA组细胞组均能 检测出pac一基因的转录,但初步判断后者的转录水平较前者低。上述结果 表明被微球包裹的DNA能在体外转染哺乳动物细胞,并在细胞内正确地转 录、翻译出相应的产物,其生物学功能没有被破坏。但在体外转染效率较低, 其原因可能与微球缓慢释放被包裹的DNA有关。 博_卜学位论文一摘要 第四,为了进一步证实构建的可示踪防龋基因疫苗的免疫学活性,以及 PELA基因疫苗释放系统对免疫效果的影响,我们进行了小鼠体内实验。将 基因疫苗裸DNA和DN刀PELA微球分别以单剂肌注,多次肌注,口服接种 等方式对BALB/C小鼠进行免疫,通过ELISA法检测血清特异性抗体。结 果显示基因疫苗DN刀PELA微球免疫组的免疫效果比裸DNA免疫组好;在 减少免疫次数,甚至单剂免疫,也能取得较好的免疫效果;而且DN户JPELA 微球经口服免疫后,尽管免疫效果较肌注免疫差,但仍比裸DNA免疫组的 免疫效果好。上述结果表明PELA包被基因疫苗后,可增强免疫效果,减少 接种次数,并可通过口服方式进行免疫。 本实验还通过GFP的指示作用及免疫组化法对基因疫苗在实验小鼠体 内各组织的分布进行了示踪研究。在荧光显微镜下观察组织中绿色荧光的表 达,并用免疫组化法检测组织中娜c一基因片段的表达。结果发


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 惠锋明;茆达干;蒋进;;DNA疫苗的运送载体——减毒霍乱沙门氏菌[J];免疫学杂志;2011年08期
2 袁子国;王晓虎;徐慧娟;张守峰;扈荣良;张秀香;;狂犬病病毒8202株糖蛋白膜外区真核表达载体的构建及其在DK细胞中的表达[J];中国畜牧兽医;2011年06期
3 ;[J];;年期
4 ;[J];;年期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
11 ;[J];;年期
12 ;[J];;年期
13 ;[J];;年期
14 ;[J];;年期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 岳朝晖;刘建国;王晶;赵靖;王伟;姜晶;管晓燕;张剑;;防龋基因疫苗pcDNA3-PAc不同途径免疫BALB/c小鼠的实验研究[A];全国第三次牙体牙髓病学临床技术研讨会论文汇编[C];2009年
2 姜晶;刘建国;王伟;耿发云;王怡丹;白朋元;亓鹏;;防龋基因疫苗pVAX1-SG免疫SD大鼠的实验研究[A];全国第三次牙体牙髓病学临床技术研讨会论文汇编[C];2009年
3 王伟;刘建国;亓鹏;姜晶;田源;白朋元;管晓燕;;防龋基因疫苗pVAX1-GC免疫SD大鼠的实验研究[A];全国第三次牙体牙髓病学临床技术研讨会论文汇编[C];2009年
4 裴宗飞;张文娟;牛钟相;;鸭补体C3d基因cDNA的克隆及鉴定[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年
5 张文卿;徐腾飞;于红;刘颖;李丹;;Her2/neu-IL12融合基因疫苗的构建及其对小鼠乳腺癌的防治作用[A];肿瘤病因学研究与中西医结合肿瘤综合诊疗交流研讨会论文集[C];2009年
6 蒋桂花;王劲松;李国才;季明春;;NspA基因疫苗小鼠体内诱生特异性抗体的研究[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
7 徐薇;岳艳;桂俊;熊思东;;佐剂的递送与表达方式对基因疫苗诱导特异性免疫应答的作用[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
8 王怡丹;刘建国;姜晶;王伟;亓鹏;白朋元;管晓燕;;防龋基因疫苗pVAX1-SPG免疫BALB/c小鼠的实验研究[A];全国第三次牙体牙髓病学临床技术研讨会论文汇编[C];2009年
9 任晓峰;石娜;崔进;孟凡丹;李训良;李鹏冲;斯琴高娃;王超;王鑫;吴丹;李广兴;;猪IL-15对PRRSV GP5基因疫苗免疫增强作用的研究[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年
10 蒋金凤;程安春;汪铭书;路立婷;;壳聚糖为递送载体的DEV gC基因疫苗诱导BALB/c小鼠体液和粘膜免疫发生的研究[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(下册)[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘莉;可示踪的防龋基因疫苗构建、表达及其基因疫苗PELA微球的研究[D];四川大学;2003年
2 王鹤;HPV58mE6E7融合基因疫苗构建及其免疫效果的研究[D];广西医科大学;2011年
3 杨广民;联合应用MAGE-1与IL-18基因疫苗抗肝癌免疫治疗作用的实验研究[D];吉林大学;2010年
4 范雄林;结核分枝杆菌基因疫苗的构建及其免疫学特性的初步研究[D];第四军医大学;2001年
5 门静涛;日本血吸虫复合表位基因疫苗免疫研究[D];吉林大学;2009年
6 李艳佳;HPV16E7DNA疫苗和IL-15重组质粒的联合免疫作用及对树突状细胞表面分子的表达和功能的影响[D];河北医科大学;2005年
7 鞠会艳;犬瘟热病毒基因疫苗与重组犬腺病毒的构建及其实验免疫研究[D];吉林大学;2006年
8 林华;PRRSV变异株的分离鉴定、鉴别诊断和新型基因疫苗的研究[D];四川农业大学;2010年
9 孟祥俊;HSV-1糖蛋白B基因疫苗的构建及其预防单纯疱疹病毒性眼病的初步研究[D];吉林大学;2007年
10 宋新强;含编码鸡Ⅱ型胶原基因的新型DNA Tolerizing疫苗的研制及其在治疗大鼠类风湿关节炎中的疗效观察[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 黎枫;1.bFGF-PELA缓释微球的研究 2.临床合理用药的多因素分析研究[D];四川大学;2002年
2 舒兵;鸭瘟病毒UL24基因疫苗的构建及其免疫效果的初步研究[D];四川农业大学;2011年
3 谢铮;人乳头瘤病毒16型E6E7基因疫苗的基础实验研究[D];扬州大学;2010年
4 沈福晓;鸭瘟病毒gC基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律[D];四川农业大学;2010年
5 王伟;免疫增效型广谱抗肿瘤血管生成基因疫苗的基础研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
6 练蓓;鸭瘟病毒gC基因部分特征分析及gC基因疫苗诱导鸭免疫发生的研究[D];四川农业大学;2011年
7 王浩;基因疫苗免疫治疗多发性骨髓瘤小鼠明显延长生存期[D];昆明医学院;2011年
8 由田;编码糖蛋白B的裸基因疫苗诱导单纯疱疹病毒Ⅰ型感染小鼠的体液和细胞免疫[D];延边大学;2010年
9 蒋金凤;鸭肠炎病毒gC基因疫苗诱导BALB/c小鼠免疫发生的研究[D];四川农业大学;2010年
10 张玉坤;超顺磁性异烟肼PELA微球体内外释放及其安全性评价的初步研究[D];重庆医科大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 ;基因疫苗防病——长期发展方向[N];中国中医药报;2000年
2 海文;基因疫苗临床研究新进展[N];中国医药报;2001年
3 杨 骏;法试制新型艾滋病基因疫苗[N];中国高新技术产业导报;2003年
4 杨骏;法试制新型艾滋病基因疫苗[N];医药经济报;2003年
5 通讯员 肖鑫;基因疫苗研制获重要进展[N];光明日报;2001年
6 记者 魏忠杰;癌症基因疫苗进入临床试验[N];新华每日电讯;2004年
7 张永兴;新加坡开发出预防哮喘基因疫苗[N];医药经济报;2004年
8 庄愉;基因疫苗研究的第三次革命[N];医药经济报;2001年
9 张建松;我国治疗性基因疫苗研究获重要突破[N];中国高新技术产业导报;2000年
10 张建松;治疗性基因疫苗研究获突破[N];医药经济报;2000年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978