脉动流对血管平滑肌细胞相关基因表达的影响及机制探讨

【摘要】： 目的 探讨人体脐动脉平滑肌细胞(Human umbilical artery smooth muscle cells，HUASMCs)的生物学特性，并建立人脐动脉血管平滑肌细胞原代、传代培养的最佳方法；采用寡聚核苷酸微阵列技术研究脉动流切应力对人体动脉平滑肌细胞基因表达影响，以及相关基因表达的调控；比较脉动流和定常流两种剪切应力作用下血管平滑肌细胞(VSMC)的基因表达的差异。 方法(1)选择体外培养的人体脐动脉平滑肌细胞第2-3代为本实验研究对象，常规免疫组化法鉴定动脉血管平滑肌细胞的α-肌动蛋白，DAB显色。将细胞悬液种植于处理过的玻片上，细胞贴壁后，加入10％新生小牛血清的DMEM培养基，再移入37℃、5％CO_2的恒温孵育箱中静置培养。待平滑肌细胞长满融合后，立即进行流体剪切应力试验。选择近生理状态下的脉动流(平均切应力为5.52 dyne/cm~2)，脉动频率为1.25Hz，切应力作用时间为6h。以同样条件下定常流切应力(5.52 dyne/cm~2，时问为6h)处理的血管平滑肌细胞为对照，以未做任何处理的血管平滑肌细胞为阴性对照。(2)提取细胞总RNA，逆转录合成单链cDNA，双链cDNA，体外转录合成生物素标记的cDNA与基因进行芯片杂交，通过抗体的检测标记荧光染料Cy3，采用基因芯片扫描仪ScanArray5000和ScanArra~(TM) Microarray Analysis System(GSI Lumonics)进行基因芯片的图像扫描，最后用Biodiscovery，Inc的软件(Imagene~(TM))和Mergne LTD.Microarray Analysis software Expressdata~(TM))完成数据分析。 结果(1)经α-肌动蛋白鉴定，组织块贴壁法可获得高纯度的HUASMCs。 原代培养的HUASMCsl~4代细胞增殖能力强、生长旺盛，此后细胞的增殖能力 逐渐降低，到第10代几乎丧失增殖力。原代培养以MCDB 131为最佳培养基。(2) 经脉动流切应力(5 .52 dyne/cmZ，频率为1.25Hz)作用血管平滑肌细胞6h 后对基因芯片扫描结果进行分析发现，有1 330个基因出现差异表达，约占基 因芯片上基因总数的10.39%，其中669个表达显著增加，661个表达显著降低; (3)经定常流切应力(5 .52 dyne/cmZ)作用血管平滑肌细胞6h后对基因芯片 扫描结果进行分析发现，在12 800个基因中有2 676个基因出现差异表达，约 占基因芯片上基因总数的20.91%，其中1 660个表达显著增加，1016个表达 显著降低;(5)分别经定常流和脉动流体切应力处理的血管平滑肌细胞基因表 达差异比较，比值大于2的上调基因有1419个，小于0.5的下调基因有878个。 这些表达差异的基因有细胞因子和受体、转录相关基因、生长分化基因、调亡 相关基因、信号传导相关基因、细胞周期相关基因、电子传递和氧化相关基因、 转移酶相关基因和癌症相关基因等。 结论(1)组织块贴壁法可获得高纯度的HUASMCs，体外培养的HUASMCs 1一4代细胞增殖能力强、生长旺盛。含10%小牛血清的MCDB131培养基对原代 细胞的增殖明显优于其它培养基。(2)相同应力状态(5 .52 dyne/cmZ，6h)的 定常流与近生理状态的脉动流(脉动频率为1.25Hz)，对体外培养的人体血管平 滑肌细胞基因在mRNA表达水平的数量、范围和调控水平有着很大的差异。生理 或病理情况下，血液流体力学的变化可使血管平滑肌细胞基因在mRNA表达水平 出现不同的的响应。(3)寡聚核营酸基因芯片技术研究血管平滑肌细胞在脉动流 和定常流切应力作用后的基因差异表达，为进一步探讨更符合人体生理或病理 情况下血管平滑肌细胞的切应力相关基因，探索切应力诱导平滑肌细胞基因表 达的机制等提供了有力的实验依据。