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力学刺激对绝经后骨质疏松大鼠成骨细胞作用的细胞分子基础

李良  
【摘要】:骨质疏松 (Osteoporosis)是以骨量减少,骨组织微观结构退化,致使骨脆性增加以及易于发生骨折为特征的一种全身性骨骼系统疾病。骨质疏松的主要危害是其并发症----骨折。长期以来已经认识到力学因素在骨质疏松的发生发展过程中具有重要的作用;除了医学治疗以外,预防和治疗骨质疏松的重要因素,就是运动。研究表明,对于绝经后妇女,体育锻炼和增加活动,有助于维持骨矿密度,降低骨质疏松的危险。在体内,力学负荷可以抑制骨吸收,增加骨形成,骨细胞可以将力学信号转变成细胞生物化学合成反应。但是,这种力学信号传导的机制仍不清楚。 本文的目的就是:1)探讨周期性双轴力学应变对体外培养的成骨细胞增殖、分化与合成功能的影响;2)探讨周期性双轴力学应变对体外培养的成骨细胞膜表面integrin α2、β1、β3表达的影响和integrin α2、β1、β3 mRNA表达的变化。3)探讨 integrin α2、β1、β3表达量变化与成骨细胞增殖和功能活性间可能的相关关系;力学信号转变为成骨细胞细胞增殖与生物合成反应可能的机制。选用3月龄和6月龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,采用双侧卵巢切除术,建立骨质疏松模型。实验分成4组:3月对照组(3control)、3月卵巢切除组(3ovx)、6月对照组(6control)、6月卵巢切除组(6ovx)。分别从各组大鼠颅顶骨分离成骨细胞,在含10%胎牛血清的F-12培养液中分别培养成骨细胞,并接种在周期性双轴力学应变装置(Flexercell)中。这种周期性双轴力学应变装置,可以提供一个基本均匀的应变场,使在硅橡胶膜上生长的成骨细胞受到一个基本相同的应变作用。当细胞生长至亚融合状态(Sub- WP=5 力学刺激对绝经后骨质疏松大鼠成骨细胞作用的细胞分子基础 ---- 李良 confluence),给细胞施加力学刺激,频率为1Hz, 力学刺激分别为400、1 000、4 000 μ strain;作用时间分别为每天30min, 2、4、8h,共加载两天。以未受力学刺激的细胞为对照组,受力学刺激的细胞为实验组,并进行比较。采用流式细胞技术测定integrin α2,β1,β3在成骨细胞膜上的表达量、细胞周期分布与细胞增殖变化;采用同位素标记方法检测成骨细胞骨钙素、I型前胶原C端前肽(PICP)和总蛋白的分泌量;采用鬼笔环肽染色肌动蛋白(F-actin),在荧光共聚焦显微镜下观察细胞骨架结构的变化。结果表明:1) 3ovx组和6ovx组大鼠切除卵巢3月后,雌激素分泌量降低,骨量减少,骨力学性能下降,表现出与妇女绝经后相似的高骨转换率骨质疏松。2) 在静态培养条件下,从各组大鼠分离的颅顶骨成骨细胞均有integrin α2,β1,β3蛋白水平的表达,其中β1表达量最高。6ovx组成骨细胞integrin α2,β1的表达量明显降低;其余各组间无明显差异。3)在静态培养条件下,3ovx组和6ovx组大鼠成骨细胞增殖活性明显增高,这与绝经后骨质疏松骨代谢的高转换率相一致。4) 3control组成骨细胞对力学刺激最敏感,较小的力学应变(400 μstrain)作用就可上调integrinα2、β1、β3的表达量,促进成骨细胞合成骨基质的能力增加,促进成骨细胞的增殖、分化。在1 000μstrain力学刺激下,3control组成骨细胞integrinα2,β1,β3的表达量出现明显上调,成骨细胞合成骨基质的能力增加也最为明显。在4 000μstrain力学刺激下,3control组成骨细胞integrinα2,β1,β3的表达量进一步增高,对3control组成骨细胞的作用主要是增加成骨细胞的增殖活性,抑制成骨细胞的分化成熟。5)6control 组成骨细胞对力学刺激的敏感性低于 3control 组成骨细胞。 在1 000μstrain力学刺激下,成骨细胞integrinα2,β1,β3的表达量出现上调;在4 000μstrain力学刺激下,成骨细胞integrinα2,β1,β3的表达量明显上调,成骨细胞合成骨基质的能力与增殖活性增加。但力学刺激对6control组成骨细胞合成分泌功能和细胞增殖活性的影响明显于小于对3control组成骨细胞的影响。6)3ovx组和6ovx组在4 000μstrain力学刺激下integrinα2,β1,β3的表达量才出现明显上调和成骨细胞的合成分泌功能的增加。表明3ovx组和6ovx组成骨细胞对力学刺激的敏感性降低。7)力 WP=6 四川大学博士学位论文------中文摘要 学刺激引起3control组成骨细胞integrinα2,β1,β3表达量上调的幅度明显高于6control、3ovx和6ovx组成骨细胞的表达;但力学刺激对各组成骨细胞integrinβ1 的上调作用最明显。8)在4 000μstrain力学刺激下,分析各组的integrin α2,β1,β3 mRNA水平表达量的变化,发现力学刺激引起integrin α2,β1,β3上调的变化是在转录前水平(Pretranslational level)受到调控的。9)在各组中,成骨细胞integrinα2、β1、β3表达的上调均伴随有成骨细胞的增殖、分化功能的相应变化,表明integrin与有成骨细胞的增殖、分化功能密切的相关性。10)力学刺激后,3control组和3ovx组成骨细胞均有大量伸长的F-actin微丝,组成微丝的F-actin纤维增粗。表明力学刺激引起了细胞骨架的重新排列和F-actin纤维重新分布。力学刺激引起细胞骨架F-actin变化的同时,也引起成骨细胞integrin表达上调。 上述实验结果提示:1)6月龄大鼠复制成年人雌激素缺失骨质疏松的模型优于3月龄大鼠骨质疏松模型。2)力学刺激可引起正常大鼠和骨质疏大鼠成骨细胞膜表面integrinα2、β1、β3表达


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