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人TCP11a、ZNF313基因在大肠杆菌中的蛋白表达及其在小鼠和人睾丸中的免疫组织化学分析

吴洽庆  
【摘要】:精子形成过程一般分为三个不同的阶段,1)精原细胞通过有丝分裂快速扩增;2)精母细胞通过减数分裂形成精细胞,在这一过程中伴有同源染色体的配对和交换;3)精细胞变形成为精子。在这三个过程中,有许多睾丸特异和非特异基因次第表达,并在生精过程中发挥着重要作用。 四川大学华西医院医学遗传室近年来致力于男性不育相关基因的克隆及功能研究工作,并取得了一些进展。通过消减杂交,mRNA差异显示等技术,克隆了多个可能与男性生育相关的新基因,如ZNF230、ZNF463、ZNF313及TCP11等。这些基因基本上在睾丸组织中均有高表达或特异表达。目前该实验室正运用酵母双杂交、基因敲除、RNAi等多种方法研究这些基因的功能。 为了在蛋白质水平研究这些基因在睾丸组织的表达情况,我们将TCP11基因和ZNF313基因克隆到大肠杆菌中进行表达,并利用表达的蛋白制备抗体,进行组织化学分析,以期了解这些基因在睾丸组织中的表达状态,对其功能进行进行推测。 第一部分:人受精促进肽受体TCP11a基因的蛋白表达及细胞组织分布 人TCP11基因编码人受精促进肽受体,该基因存在多个剪切体。我们选择剪切体TCP11a基因进行表达,制备抗体以研究TCP11蛋白在睾丸及精细胞上的分布。 通过PCR等分子克隆技术,我们将TCPlla基因克隆到pBv220表达载 体上,通过DNA测序及表达产物的N一端测定证实了克隆基因表达产物的正确 性。然后我们还对工程菌TCPlla蛋白的表达条件进行了研究,使TCPlla蛋 白在工程菌中高效表达。并利用表达蛋白制备的抗体进行了组织化学分析。 结果显示:TCPll蛋白在鼠皋丸组织中分布具有细胞特异性,即它仅见于长 形精子细胞的细胞质中和细胞膜上,而在精原细胞、精母细胞、支持细胞、 间质细胞和精子的细胞核中均未观察到。这提示TCPll基因可能在精子的最 后成熟时期才发挥作用,并对精子形态及其生理功能有重要作用。对可育男 性成熟精子的荧光标记结果显示,TCPn蛋白主要分布于精子的顶体和尾部, 该结果与鼠TCPn蛋白在其精子表面分布结果基本一致。 在上述工作基础上,运用生物信息分析方法,对TCPll基因及TCPlla 蛋白进行了深入分析。将人TCPll基因与小鼠、大鼠、鸡及猩猩的同源基因 进行了同源性分析,包括比较各外显子和内含子的保守性,结果发现在TCPn 基因上游约3Okb的范围内有许多保守的非编码序列,它们很可能是调控 TCPn基因特异性表达的增强子或其他调控元件。对其中最保守的一个非编 码序列进行共有调控因子结合位点预测的结果,发现该序列内存在较多的重 要调控因子的结合位点。对人TCPll基因的CPG岛分析发现在人TCPH启动 子区周围存在的一个CpG岛,同样存在于大鼠、小鼠。启动子区CpG岛的甲 基化和去甲基化可能参与了TCPn的转录调控。对TCPlla蛋白的二级结构 预测的结果发现,该蛋白结构十分特殊,二级结构中仅有Q一螺旋结构。它 有较多的潜在的翻译后修饰位点,特别是不同类型的磷酸化位点。对TCPll 基因和蛋白质结构的分析有助于了解它们的功能。 第二部分:人精子发生相关基因--一多W召了3在大肠杆菌中的克隆表达及组 织分布 锌指蛋白是一类广泛存在于动植物及人类的DNA结合蛋白。由于能选 择性地结合各种DNA和RNA序列,它们在基因的表达调控中起着十分重要的 作用。CZHZ和C3HC4锌指是较为常见的两种锌指结构域,但很少同时存在于 同一个锌指蛋白。而我们克隆表达的ZNF313蛋白却同时含有这两种结构域。 利用PCR方法,将人ZNF313基因克隆到pET一32(a)载体上,使之以融 合蛋白形式表达。在DNA序列测定、蛋白N一端序列测定证实了克隆表达的正 确性后,我们对工程菌发酵条件、蛋白纯化条件进行了研究,并利用纯化的 ZNF3 13蛋白制备抗体供人辜丸组织切片组织化学分析。免疫组化分析显示在 精原细胞、圆形精子细胞、精母细胞的细胞核中出现,而Sertoli细胞、精 子细胞中未.呈阳性反应。这表明ZNF313基因在翠丸特定细胞类型的特定阶 段中进行表达,并提示它在生精过程中可能发挥重要作用。 对ZNF313蛋白和基因的生物信息学分析获得了如下的结果:1)ZNF313 锌指结构域的3D结构模拟发现ZNF3 13的Ring锌指和第二个CZHZ锌指均可 以形成正常的锌指结构;2)通过EST序列拼接电子克隆法获得了称猴、大 鼠、非洲蛙、非洲爪蟾、青鳄、虹蹲及猪的ZNF313直系同源基因,通过基 因组比对,获得了鸡的ZNF313同源基因。蛋白质水平的比对发现:不同种 生物ZNF313的RING和三个CZHZ锌指结构其周围的氨基酸序列均十分保守, 提示几个锌指结构域对于ZNF3 13的生物学功能可能具有十分重要的作用。3) 对人和黑猩猩ZNF313基因上游调控因子的结合位点分析表明:转录起始位 点上游30一13Obp处有一个十分保守的区域,后者包涵有有许多重要转录调 控因子的潜在结合位点。它们可能是与调控因子相互作用的靶点。然而人 ZNF313与小鼠Znf313的上游调控因子结合位点比较则发现它们的同源保守 性较低,这是否意味着人与小鼠ZNF3 13的基因转录调控模式不同,尚待研 究。4)旁系同源基因分析结构表明,在人16q24.3区域存在的一个基因, 其蛋白结构与ZNF313非常相近


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