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高效灭蝗基因工程菌的构建

张杰  
【摘要】:首先利用启动子探针型载体pSUPV4直接在大肠杆菌中克隆类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)基因启动子片段,获得具有强启动子的重组子pPA7。对PA7片段的序列分析发现其距5′端931bp-1091bp处具有原核生物典型基因启动子的保守结构-10区和-35区,以及翻译必需的SD序列和翻译起始位点等。 分别设计正向引物FPPA1、FPPA2,反向引物RPPA1、RPPA2对PA7片段进行PCR次克隆后定向连接到pSUPV4的多克隆位点区并保证阅读框不变,得到三个次克隆重组子卡那霉素抗性测定发现次克隆重组子的抗性相似,为600μg/ml左右,证明pPA7-2所克隆的5′端899-1120bp片段在大肠杆菌中具有启动子的功能,5′端1120bp后的片段缺失对启动子没有影响。5′端0.7Kb片段缺失明显影响启动子活性,推测该片段可能对启动子具有增强的作用。 应用电穿孔转化法将pPA7转入类产碱假单胞菌,卡那霉素抗性测定发现经过转化的类产碱假单胞菌卡那霉素抗性明显高于未经转化的类产碱假单胞菌,证明PA7片段在类产碱假单胞菌中具有启动子功能。对次克隆得到的重组子pPA7-2以同样的方法进行验证,表明其在类产碱假单胞菌中也具有启动子功能。对PA7片段进行Southern杂交鉴定证明该片段来自于类产碱假单胞菌基因组且可能以单拷贝存在。 克隆了类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因并对杀虫蛋白启动子及信号肽进行分析。将类产碱假单胞菌基因组DNA经Sau3AI部分酶切后,与BamHI酶切的pUC19质粒连接并用于转化大肠杆菌DH5α。用根据纯化杀虫蛋白的N末端氨基酸序列测定结果,合成寡聚核苷酸探针,与所获得的重组菌落进行筛选,经两轮筛选得到5个阳性克隆,其中一个阳性克隆pSCl用于进一步鉴定。寡聚核苷酸探针杂交揭示pSCl的1.4kbBamHI-KpnI酶切片段含有杀虫蛋白基因,该片 四川大学博士学位论文 段经测序分析证实存在一个较长的开放阅读框,可编码276个氨基酸残基构成 的蛋白质。该基因的推测氨基酸序列包括22个氨基酸残基构成的信号肤序列和 254个氨基酸残基构成的成熟蛋白序列。22个氨基酸残基构成的肤序列位于成 熟蛋白序列之前,其信号肤仅具有C末端区及不典型的N末端区和同时缺乏明 显的疏水区(H一domain),与细菌素和信息素信号肤特征类似。该信号肤不能利用 现存的生物信息学模型如SignaIP进行运算预测。杀虫蛋白基因5’端侧翼区含 有与大肠杆菌核糖体结合位点相似的Shine一Dalgamo序列,但未发现类似于大 肠杆菌启动子一10区和一35区的序列。序列比较显示,类产碱假单胞菌杀虫蛋白 与其它细菌毒素蛋白之间缺乏明显的同源性。 通过生物信息、学的方法将环状芽抱杆菌阔acizzus eirculans)e一2 Chil几T质 酶序列及功能域进行分析,同时还利用二级结构预测(P HDsec)预测、通过SignalP 进行信号肤判断及剪切位点预测、das一跨膜预测,通过Swissmodel进行3D结构 分析等生物信息方法对利用PA7启动子及杀虫蛋白基因启动子PSC的两种连接 方式进行评估预测,两种连接方式基本上不会影响编码蛋白的空间结构,几丁 质酶基因Chil的信号肤序列在革兰氏阴性菌中不会改变其性质及剪切位点。因 此在理论上两种连接方式可行的。 通过使用引物设计软件Primeos设计引物,在PCR扩增体系中添加DMSO, 克服扩增中两端引物的Tm值大的差别,成功扩增CHI、CSP、LQZ、PSC片段。 以pLAFR3质粒为载体,在经过相同特异性酶切后获得与克隆片段酶切后匹配的 粘性末端,构建重组质粒pLCHll、pLCHIZ。以大肠杆菌HB101印RK2013)为辅 助质粒,通过三亲转化的方法将经过四环素抗性筛选过的HBlol印LcHn)、 HB101(P LcHI2)重组子的质粒导入类产碱假单胞菌。在含四环素以几丁质为唯 一碳源的培养基上筛选出转化子PLCHll、PLCHIZ。转化子能将几丁质酶基因 分泌到胞外。以转化子PLCHll为模板,通过PCR反应扩增到LQZ、CSP片段; 以PLCHIZ为模板,扩增到PSC、CHI片段。southem杂交证明几丁质酶基因片 段来自pCHll。转化子的几丁质酶活测定表明PLCHIZ的胞外酶活达到10.SU/L。 SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳分析显示转化子均能产生约74KD的蛋白质带与 PCHll一致。室内的蝗虫喂饲实验表明PLCHIZ致死率达85%,比出发类菌致死 率68%有显著提高。 关键词:类产碱假单胞菌,基因启动子,基因克隆,几丁质酶,表达载体构建, 三亲转化,分子鉴定,功能鉴定 X1


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