八珍汤对小鼠造血功能影响的机制研究

【摘要】：本论文依照中医“气为血之帅”、“血为气之母”的理论思维，运用现代生物检测技术，从宏观整体到细胞、亚细胞、分子水平研究八珍汤对小鼠造血功能的影响。 八珍汤源自《正体类要》，作为中医古方气血双补的经典方，由当归、川芎、白芍药、甘草、熟地黄、人参、白术、茯苓组成。其药理作用近年已多有报导。临床实验表明：八珍汤不仅能治疗白细胞减少症，而且能改善严重的骨髓抑制。然而至今都未见有对其拮抗骨髓抑制在细胞水平和分子水平上的机理研究报道，为进一步深入探讨八珍汤影响造血的作用机理，以期为中医气血理论的科学内涵提供现代科学的实验依据，从而为临床用药提供更加详细和深入的理论依据，进一步推动中医气血理论的发展。我们应用现代分子生物学的理论较全面系统的阐明了八珍汤的补血作用。 本实验利用注射环磷酰胺(CY)等方法使小鼠造血功能受到抑制，造成血虚模型，观察八珍汤对正常小鼠和血虚模型小鼠造血功能的影响。 1、研究八珍汤对血虚模型小鼠和正常小鼠外周血象的影响调节作用。实验发现：模型组比空白组的白细胞计数下降了30.7％，血小板计数下降了20.5％；而八珍汤+模型组则只分别下降了7.9％和3.4％，说明八珍汤能对抗CY所致的小鼠外周血象的降低，使其基本恢复到正常水平。 2、研究八珍汤对血虚模型小鼠和正常小鼠骨髓细胞增殖的影响调节作用。实验发现：小鼠腹腔注射环磷酰胺后第4天模型组小鼠的骨髓细胞增殖能力较正常组下降60.2％，而八珍汤+模型组小鼠的骨髓细胞增殖能力只比正常组下降41.7％。其后，模型组小鼠的骨髓细胞增殖能力缓慢回升，但仍明显低于八珍汤+模型组小鼠。表明八珍汤能显著提高小鼠骨髓细胞增殖能力。 四川大学博士学位论文 3、采用脾结节计数法，研究八珍汤对血虚模型小鼠造血干细胞生成的影响。 实验发现:八珍汤组小鼠生成的脾结节数明显高于空白对照组，表明八珍汤能 促进小鼠骨髓中造血干细胞的增殖。 4、研究八珍汤对血虚模型小鼠和正常小鼠的CFU一GM集落数的影响调节作 用。实验发现:八珍汤对血虚模型小鼠和正常小鼠的CFU一GM的增殖能力都有 明显促进作用(P0 .01)，表明八珍汤对骨髓有核细胞(即造血祖细胞)有整体 影响，且在造血祖细胞分化后，八珍汤对分化后的祖细胞也有明显的促进增殖 作用。 5、研究经八珍汤体内诱导制备的脾细胞条件培养液(SCM)、肺条件培养液 (LCM)、腹腔巨噬细胞培养液(PM中CM)、肌条件培养液(SMCM)对血虚模型小 鼠和正常小鼠的骨髓有核细胞增殖的影响调节作用。实验发现:经八珍汤体内 诱导制备的SCM，对小鼠骨髓有核细胞的增殖有明显的促进作用，与模型组相比， 在稀释度为1:4、1:8、1:32时对小鼠骨髓细胞的增殖作用均有极显著差异 (p0.01);经八珍汤体内诱导制备的LCM，，在各稀释度时对小鼠骨髓有核细胞 增殖有明显的促进作用:经八珍汤体内诱导制备的PM中CM，对血虚小鼠骨髓有 核细胞的增殖有明显的促进作用，在各稀释度下都有显著性差异，且对骨髓细 胞的增殖作用随稀释度的增大而增大:经八珍汤体内诱导制备的SMCM在稀释度 为1:4和卜32时对小鼠骨髓有核细胞的增殖均有明显的促进作用。 6、研究八珍汤对小鼠细胞分泌1L一1、IL一2、几一3的影响。以分别对IL 一1、工L一2、工L一3敏感的细胞作为靶细胞，以MTT法测定药物的影响。实验发 现:空白组和模型组小鼠灌胃八珍汤药液后，腹腔巨噬细胞产生1L一1的能力 有一定的提高，其中稀释度为1:4和1:8时的八珍汤十空白组与空白组相比 有极显著差异;脾淋巴细胞产生IL一2的能力有较大的提高，在稀释度为l:8 时工L一2样品有最好的刺激靶细胞增殖的能力;脾淋巴细胞产生IL一3的能力 有明显的提高，八珍汤十空白组与空白组相比在稀释度为1:4和1:8时有极 显著性差异，稀释度为1:32时有显著性差异;八珍汤+模型组与模型组相比 在各稀释度时均有极显著性差异。 7、研究八珍汤对脾条件培养液和腹腔巨噬细胞培养液中红细胞生成素生成 的影响。实验发现:小鼠脾条件培养液中稀释度为1:4时八珍汤+空白组与空 白组相比，八珍汤十模型组与模型组相比其红细胞生成素的生成均有极显著性 四川大学博士学位论文 差异。腹腔巨噬细胞培养液中八珍汤+空白组与空白组相比在稀释度为1:8时 有显著性差异。 8、探讨八珍汤对血虚模型小鼠的骨髓基质细胞分泌TNF的影响调节作用， 实验发现:八珍汤能抑制血虚小鼠骨髓基质细胞分泌TNF，且在稀释度为1:4 和l:32时较模型组有显著性差异。 9、探讨八珍汤对6OCoY射线照射小鼠骨髓细胞及脾细胞凋亡的影响。实验 发现:八珍汤对60CoY射线照射小鼠骨髓细胞及脾细胞凋亡有较好的抑制作用， 与模型组相t匕/又珍汤+模型组的小鼠骨髓细胞和脾细胞凋亡数在6h处有显著性 差异。 10、分别提取给药组和空白组小鼠的总RNA，通过RT一PCR方法半定量检 测八珍汤对IL一mRNA、IL一ZmRNA、IL一3mRNA生成的影响。实验发现:八珍 汤能够极为显著地提高1L一1、IL一2、IL一3的转录水平(P0 .01)。表明八 珍汤能够促进小鼠细胞产生工L一lmRNA、IL一mRNA、工L一3诚NA。 11、通过病理切片，镜下观察骨髓细胞的