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利用淀粉的酿酒酵母工程菌的构建

刘增然  
【摘要】:以扣囊复膜胞酵母菌总DNA、工业酿酒酵母总DNA和毕赤酵母表达载体pMETαB为模板,通过PCR扩增克隆到约1500bp、2950bp和300bp的α-淀粉酶基因(AMY)、α-乙酰乳酸合成酶基因(ILV2)和α因子分泌序列(MFalS),将其分别插入YEp352和pBlueseriptMl3~-质粒获得克隆载体pLA6、pLV2和pBLα。克隆载体的酶切分析表明二克隆基因与GenBank的报道序列基本相同,克隆到的α-淀粉酶基因与GenBank中报道序列的酶切位点有差异,克隆基因内有SacⅠ酶切位点,大约距起始密码子100bp,GenBank中报道的基因序列无SacⅠ酶切位点;而报道的α-淀粉酶基因序列在距起始密码子72bp处有BglⅠ酶切位点,克隆α-淀粉酶基因无BglⅠ酶切位点。克隆的乙酰乳酸合成酶基因内有一个XbaⅠ酶切位点,而报道的序列有两个酶切位点,其它酶切位点均相同。 以酵母菌穿梭载体YEp352为出发质粒,酵母磷酸甘油酸激酶基因1(PGKl)启动子和乙醇脱氢酶基因1(ADHl)终止子为调控元件构建了含α-淀粉酶编码序列的酵母菌重组表达质粒pLA8。用醋酸锂转化法将pLA8导入单倍体酿酒酵母菌株,转化子可以在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长,并使受体菌的ura缺陷型得到互补。说明克隆到的淀粉酶基因可以表达有活性的淀粉酶。将pLA8导入工业酿酒酵母菌株Sc-11,在以淀粉为唯一碳源的YNBS培养基上筛选阳性转化子,转化子培养液中α-淀粉酶活性为1.1U/ml,细胞破碎液的酶活性为0.3U/ml,淀粉水解率为38%。说明扣囊复膜胞酵母菌(S.fibuligera)α-淀粉酶 四川大学博士论文 基因分泌序列不能在工业酿酒酵母菌sc·11中有效引导a一淀粉酶分泌至胞外, 使部分a一淀粉酶滞留在胞内。转化子的遗传稳定性为71%。 鉴于pLAS的酵母转化子淀粉酶表达量低,并有部分滞留在胞内,为了有效 引导淀粉酶分泌至胞外,促进转化子的淀粉酶分泌,在AMY编码序列起始密码 子前插入酵母a一因子分泌序列构建酵母菌重组表达质粒pLA8a。用醋酸铿转化 法将pLA8a导入工业酿酒酵母菌,在以淀粉为唯一碳源的YNBS培养基上筛选 阳性转化子sc一11一pLA8a,转化子培养液中a一淀粉酶活性为6.3U/ml,说明a一分 泌序列可以有效引导a一淀粉酶分泌至胞外并促进菌体细胞生长。转化子在最佳 条件下降解83%的淀粉,可以用于淀粉发酵。进一步对转化子进行麦芽汁糖发 酵试验,检测了其发酵麦汁中残糖含量、乙醇含量和风味物质的含量。结果表明 残糖含量降低18%,AM了基因的引入对酵母的发酵特性未产生很大影响,可以 认为转化子的发酵特性与受体菌一致,转化子遗传稳定性为80%。 因为自主表达质粒在受体细胞体中表达存在不稳定现象,在工业化的长期 应用中可能丢失,使工程菌利用淀粉性状丢失。本研究采用构建整合表达工程菌 来克服遗传新性状表达不稳定性问题。考虑到酵母菌是食品级微生物,在啤酒发 酵中产生a一乙酞乳酸,并渗透至胞外非酶转化为双己酞,影响啤酒风味,使啤酒 有几周的后熟期。本研究以a一乙酞乳酸合成酶基因为同源整合序列构建了整合 质粒pMGI3。pMGI3经月尸口I十Notl酶切获得约5.6kb含tlvZ::A几tY嵌合基因片 段,用于酵母转化并在YNBS培养基上筛选阳性转化子sc·1卜MGI3。经PCR 验证淀粉酶基因整合在受体染色体的IL人基因上,sDs一PAGE证明在约55kDa 处有一条明显的蛋白条带。转化子培养液中a一淀粉酶活性为4.3U/ml,转化子不 仅可以利用淀粉为唯一淀粉而生长并使a-乙酞乳酸酶活性降低30%;淀粉发酵 实验表明其可降解65%的淀粉:麦芽汁发酵实验证明发酵液双乙酞含量和残糖 含量分别降低70%和13%;转化子在非选择培养条件下的遗传稳定性为100%, 而其它发酵特性与受体菌相比无很大差异。转化子不含细菌抗生素抗性基因和 酵母抗药性选择标记。 本研究证明通过PCR扩增获得的翅材y编码基因在酵母磷酸甘油酸激酶基 因l(尸GK了)启动子和乙醇脱氢酶基因1(A DHI)终止子为调控元件下表达具 生物活性的a一淀粉酶。所构建的酵母穿梭表达质粒pLA8a转化子可以有效分泌 表达淀粉酶,表达量高,可用于以淀粉为原料的工业发酵制品生产;但其在工业 四川大学博士论文 应用中存在丢失现象,遗传稳定性较差。所构建的整合表达片断转化子 Sc一11一MGI3可以有效分泌表达淀粉酶,表达量较高,其遗传稳定性高,适于在 工业发酵生产应用,尤其适于工业啤酒生产。 关键词:淀粉酶基因,克隆和表达,乙酞乳酸合成酶基因,工业酿酒酵母, 遗产稳定性,双乙酞


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