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hPER1 bHLH-PAS结构域酵母双杂交系统的构建

李英明  
【摘要】:从低等生物—蓝细菌到高等动物一人,几乎所有生物体都存在受内在振荡器—近日钟系统调控的近日节律。近日钟系统由钟基因及其蛋白的转录和转录后调控所构成的正负反馈环路构成。目前,在生物体内已发现了许多钟基因,但近日节律的产生和调节机制仍不清楚。 在众多种蛋白中,PER1广泛分布于生物体内,在近日钟系统中处于重要地位。研究表明,PER1在SCN主要起维持系统的稳定和精确的作用,在外周组织起控制节律周期的主导作用。和许多其他钟蛋白一样,PER1含有bHLH-PAS结构域,而bHLH-PAS结构域是许多转录调节因子的关键结构。为了寻找与hPER1相互作用的新蛋白、进一步研究近日节律的产生和调控机制,我们以hPER1的bHLH-PAS结构域为诱饵蛋白构建酵母双杂交系统。 通过RT-PCR扩增hPER1 bHLH-PAS结构域的编码序列,扩增的片断与质粒载体pGBKT7连接重组为诱饵质粒pGBK77/hPer1_(bHLH-PAS)。检测转化诱饵质粒的酵母AH109是否有自激活发生以及重组诱饵蛋白的毒性。取自然流产胎儿的下丘脑区脑组织提取总RNA。自总RNA提取的mRNA用BD SMART Ⅲ technology扩增ds cDNA。将重组诱饵质粒、ds cDNA和pGAD77-Rec转化酵母AH109进行双杂交。通过三缺和四缺培养基,筛选得到阳性克隆。然后,用β-半乳糖苷酶印膜法检测阳性克隆内lacZ报告基因的表达,PCR扩增酵母双杂交阳性克隆内与pGADT7-Rec同源重组的脑cDNA片断,以进一步验证了阳性克隆的正确性。 经酶切和基因测序鉴定证实重组诱饵质粒pGBKT7/hPer1_(bHLH-PAS)构建成功。诱饵蛋白实验证实无自激活作用,对酵母AH109是无毒的。双杂交 后共筛选得到26个阳性克隆。通过各种筛选验证实验说明以甘ERI的 bHLH一队S结构域为诱饵蛋白的酵母双杂交系统构建成功。 筛选得到的阳性克隆为寻找脑组织中能与hPERI相互作用的未知蛋 白,研究人近日节律系统的分子机制奠定了基础。 关键词:hPERI;酵母双杂交;重组诱饵质粒;cDNA文库


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