血小板反应素1活性cDNA片段的克隆与表达

【摘要】：血小板反应素1(Thrombospondin-1,TSP-1)是同源三聚体糖蛋白和血小板a颗粒的主要组成部分。在胎儿发育过程中或成人受伤时,TSP-1在上皮细胞和中胚层细胞中表达。TSP-1与凝血功能和细胞附着有关,在不同的细胞和不同的条件下,还可刺激或抑制细胞生长与迁移,并抑制血管新生。TSP-1抗血管新生的功能可以应用于肿瘤治疗。根据已有研究结果,TSP-1抑制血管新生的功能主要依靠Ⅰ型原胶原同源片段和3个备解素样(properdin)的Ⅰ型重复序列区。在本研究工作中首先设计了2对引物,分别用于RT-PCR扩增TSP-1-1(Ⅰ型原胶原同源片段和3个Ⅰ型重复序列区)和TSP-1-2(Ⅰ型重复序列区)片段,经测序验证后,再分别克隆到大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中进行表达,并对表达产物进行了纯化。主要结果如下: 1.利用2对引物,从人血细胞中克隆到TSP-1-1和TSP-1-2 cDNA片段,序列分析显示,它们分别长699和528bp。 2.将上述2个cDNA片段插入到大肠杆菌表达载体pET-29a中,获得重组子,经过IPTG诱导以包涵体的形式表达出相应的多肽片段,其分子量分别为30kD和20kD。用尿素对包涵体进行体外溶解,通过离子交换(CM-Sepharose)层析,获得了TSP-1-2多肽。 3.再将上述2个cDNA片段插入到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pICZ α A中,获得重组子,含有TSP-1-2的酵母经过甲醇诱导分泌表达出相应的多肽片段,其分子量为20kD。