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RNA干涉抑制子宫颈癌HPV16 E6基因的研究

牛晓宇  
【摘要】:目的 采用RNA干涉技术干扰宫颈癌CaSki细胞中HPV16 E6基因转录,通过体外实验和雌荷瘤裸鼠体内实验以了解其能否特异性沉寂HPV16 E6基因及其时效性,以及对体内肿瘤的抑制效果。方法 设计合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,测定转染后不同时间点的细胞凋亡率,RT-PCR测定HPV16 E6 mRNA变化,Western blot和流式细胞仪检测转染前后HPV16 E6蛋白表达情况。建立子宫颈癌动物模型,将siRNA注入裸鼠腹腔或瘤内直接给药,测定肿瘤体积的变化,HPV16 E6组织切片免疫组化和肿瘤细胞凋亡TUNEL检测。结果 HPV16 E6 siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为:7.7%,11.8%,37.4%和12.6%。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77%,83%,59%和41%,阴性对照组HPV16 E6 mRNA量和作为内对照的β-actin mRNA在转染前后无变化。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少,9d时抑制率有所下降;流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示,转染后24h、48h、5d蛋白表达抑制率分别为:79.7%,80.4%,71.3%,9d时抑制率有下降,但仍可达57.4%;siRNA阴性对照和内对照Lamin A/C在不同的时间点表达均无差异。体内实验中无论腹腔还是瘤内注射HPV16 E6 siRNA均明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤组织坏死和细胞凋亡明显增加,两次给药较单次给药效果更好。结论 宫颈癌CaSki细胞中确实有RNA干涉现象存


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