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腺病毒载体介导的反义VEGF_(165)基因治疗人皮肤恶性黑色素瘤的实验研究

崔正军  
【摘要】:肿瘤的血管新生(Angiogenesis)理论是由Folkman于上个世纪七十年代首先提出,研究表明血管新生是实体瘤生长和转移的基础,肿瘤从新生血管中获取营养和排泄废物,肿瘤的微血管数量几乎与所有的实体瘤的生长和预后均密切相关。 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种重要的促血管生成的细胞因子,具有特异性促血管内皮细胞有丝分裂和强烈的增加毛细血管通透性的作用,以VEGF为靶点的抗肿瘤血管新生治疗是目前研究的热点。 本研究采用反义VEGF_(165)基因在mRNA水平抑制靶基因表达的策略,采用重组腺病毒介导的的反义VEGF_(165)基因转染的方法,以能够分泌血管内皮生长因子受体(VEGFR)的人血管内皮细胞ECV_(304)和分泌VEGF的人皮肤恶黑细胞株A_(375)为研究对象,分别从体外和体内实验两方面研究反义VEGF_(165)基因转染对上述细胞的生物学特性和血管新生的影响,探讨反义VEGF_(165)基因转染在治疗恶黑中的意义,为进一步开展临床应用研究奠定基础。该系列研究的目的、方法、结果、结论如下: 实验一 腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)和腺病毒介导的反义血管内皮生长因子_(165)(Ad-aVEGF_(165))的扩增、纯化、和滴度测定 目的:扩增、纯化Ad-GFP和Ad-aVEGF_(165),并测定滴度。方法:在293腺病毒包装细胞中复制和扩增Ad-GFP和Ad-aVEGF_(165)。反复冻融293细胞,提取腺病毒悬液,用氯化铯(CsCl_2)梯度离心法纯化腺病毒,在荧光显微镜下测定Ad-GFP的滴度,用空斑法测定Ad-aVEGF_(165)的滴度。结果:获取了实验所需的第四代腺病毒


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