大鼠骨髓间充质干细胞三维定向诱导和体内构建组织工程软骨的初步实验研究

【摘要】：目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、培养、冻存、复苏办法,比较MSCs在平面条件和在三维支架下向软骨细胞诱导的差异,细胞增殖力、细胞周期的变化,以及在裸鼠体内构建组织工程软骨的可能性。方法:采用梯度离心法和贴壁培养法分离MSCs,对所分离细胞进行SH_3免疫组化鉴定,用含70%DMEM培养基、20%FBS、10%DMSO组成的冻存液在4℃、-70℃、-196℃的分阶段降温冻存MSCs,及快速复苏。用TGF-β_1为主的诱导因子在平面条件下或在胶原、明胶支架上将MSCs向软骨细胞诱导,观察细胞在材料上的贴附率,对诱导细胞行Ⅱ型胶原免疫组化、原位杂交检测,MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖力、细胞周期变化。将诱导后细胞与胶原海绵、藻酸盐凝胶复合,植入裸鼠体内,4w、8w检测体内组织工程软骨的形成情况。结果:使用以上两种分离方法分离出MSCs,经SH_3免疫组化鉴定,复合MSCs的特征,P1、P5代冻存和复苏细胞数成活率在85%以上,使用的以TGF-β_1为主的诱导因子,在平面条件下或在胶原、明胶支架上将MSCs向软骨细胞诱导,Ⅱ型胶原免疫组化、原位杂交检测均为阳性。MSCs在胶原支架上分泌Ⅱ型胶原数量、细胞增殖力、细胞数均比平面诱导条件下高,MSCs在胶原支架上生长,细胞周期与平面诱导条件下相比未发生明显改变,细胞无畸