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肝干细胞作为肝细胞癌靶向基因治疗载体的实验研究

钟晓刚  
【摘要】:目的:构建稳定表达外源标记基因的工程化肝干细胞,在体外共培养体系及动物体内移植实验中观察标记肝干细胞对肝癌细胞的定向趋向能力,初步探讨以肝干细胞作为肝细胞癌靶向基因治疗载体的可行性。 方法:1.采用细菌同源重组法构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因腺病毒载体pAd-CMV-EGFP,在人胚肾293细胞中包装制备腺病毒,并用重组腺病毒感染体外培养的大鼠肝干细胞WB-F344,观察腺病毒携带的外源基因EGFP在WB-F344细胞中的表达及对肝干细胞的感染效率。单克隆培养纯化建立稳定表达EGFP的细胞株(WB-EGFP),并采用流式细胞术、免疫细胞化学技术、诱导分化实验以观察其生物学特性。 2.利用重组腺病毒介导EGFP在大鼠肝干细胞WB-F344和原代培养的胚胎成纤维细胞中表达,建立工程化稳定表达EGFP的肝干细胞WB-EGFP、大鼠胚胎成纤维细胞REF-EGFP。在相互隔离的条件下,共培养肝癌细胞CBRH7919和肝干细胞WB-EGFP或成纤维细胞REF-EGFP,连续动态观察肝干细胞在共培养体系中迁移的生物学行为,以探讨肝干细胞是否有趋向肝癌细胞的特性。3.将肝癌细胞CBRH7919在免疫抑制的Wistar大鼠肝脏原位注射,建立大鼠肝癌原位动物模型,从尾静脉注射EGFP标记的


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