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黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)转化系统的建立及木质素酶cDNA的同源表达

李维  
【摘要】:首先采用PCR技术从质粒pAN7-1中扩增来自大肠杆菌的潮霉素磷酸转移酶基因编码区序列,将该编码区DNA片段克隆到质粒中间载体pSUGV2中,得到质粒pHYG; 然后从质粒pUGLG2中用限制性酶切的方法,分离黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)木质素过氧化物酶基因lip6的终止子序列,并将其克隆到质粒pSUGV1中,得到质粒pGLG2-T; 最后从质粒pHYG中切出潮霉素磷酸转移酶基因编码区片段,插入到质粒pGLG2-T中,由此所获得的重组质粒即是以潮霉素磷酸转移酶基因为报告基因的启动子探针型载体,命名为pSUPV8。 用该启动子探针型载体直接在大肠杆菌中克隆到6个来自黄孢原毛平革菌的具有基因启动子活性的DNA片段(分别命名为CH1~CH6),DNA片段的大小在0.1-2.1 kb之间。对其中具有代表性的基因启动子片段CH6的结构和功能作了较为详尽的研究。该片段长约1.1 kb,赋予大肠杆菌300μg/mL的潮霉素抗性。除去其5’端0.5 kb的片段,潮霉素抗性降低到原来的1/2,推测该0.4 kb的片段中可能存在一个正调控序列。Southern杂交表明CH6以单拷贝存在于黄孢原毛平革菌基因组中。对启动子片段CH2和CH6所作的序列分析,结果表明,二者均存在典型的真核生物基因启动子结构特点,同时也具有与原核生物基因启动子相似的一些保守序列。实验结果还表明,潮霉素磷酸转移酶基因5’端编码区核苷酸序列的改变,并不影响基因表达产物的生物学活性,证明该基因可用作报告基因用于基因启动子的分离、启动子效率的测定以及其它DNA调控片段功能的研究等等。


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