黄孢原毛平革菌Peroxiredoxin基因的克隆和表达

【摘要】：硫氧还蛋白过氧化物酶(Peroxiredoxin，简称Prx)是一类新发现的抗氧化酶，广泛存在于原核和真核生物体内。真菌在有氧代谢过程中，抗氧化酶在除去氧自由基保和护生物体中发挥重要的作用。以黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)3d培养物制备的总RNA为模板，利用快速末端扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术得到其5’-端和3’-端序列，并拼接获得该基因的全长cDNA序列，命名为PcPrx(NCBI收录号为AY787751)。该cDNA全长为932 bp，5’-非翻译区(5’-UTR)含61bp，3’-非翻译区(3’-UTR)含268 bp，其中ORF含603bp，编码200个氨基酸残基。预测该蛋白分子量为22.1 kDa，等电点为4.8。PcPrx的一级结构分析表明，该基因与其他真菌中的同种基因的同源性为60％，与非真菌的同种基因也显示出较高的同源性，如与人的同源性为60％，与拟南芥的同源性为40％。利用SWISS-PORT网站预测出该蛋白的三维结构。 利用RT-PCR技术分析该基因在2d和3d P. chrysosporium的培养物中的表达差异，结果显示该基因在进入次生代谢后，表达量明显增加。将该基因的开放阅读框连接到pET-30表达载体中，在大肠杆菌中表达，获得了该基因的重组蛋白。经NI柱纯化的蛋白，在金属催化氧化系统中，具有保护超螺旋质粒不被氧自由基降解的能力。同时该重组蛋白在ferrithiocyanate体系中有清除H_2O_2的能力。纯化的蛋白在还原剂二硫苏糖醇的作用下发生解离，经非还原性SDS-PAGE分析，该蛋白存在二聚体。PcPrx基因的克隆和表达为阐明黄孢原毛平革菌在进入次生代谢阶段如何抵御逆境提供了新的线索。