甘薯淀粉酶组织特异性及基因克隆和表达

【摘要】：通过液氮研磨提取甘薯愈伤组织和块根可溶性提取物，并采用非变性凝胶电泳和淀粉酶活性染色方法的研究发现，甘薯愈伤组织有4种迁移率不同的淀粉酶活性带，而块根只有1条淀粉酶活性带。以特异性底物支链淀粉对4种迁移率不同的淀粉酶进行类型鉴定，愈伤组织有2种α-淀粉酶和2种β-淀粉酶，而块根只有一种β-淀粉酶。淀粉酶抑制剂EDTA和β-巯基乙醇的敏感实验结果显示，块根β-淀粉酶对2种抑制剂都不敏感，而愈伤组织的淀粉酶则对2种抑制剂都敏感。 甘薯愈伤组织诱导及继代培养基组成成分都可能对淀粉酶基因的表达产生影响。不同激素对甘薯愈伤组织淀粉酶基因的表达都有重要作用，蔗糖的作用尤为重要。对甘薯愈伤组织进行不同时间的高温、低温、水涝、高温-水涝和低温-水涝处理后，对其可溶性提取物做非变性凝胶电泳和活性染色，发现它们对愈伤组织中3种主要淀粉酶基因的表达均具有不同程度的影响。在高温下的3种主要淀粉酶在前24h左右变化幅度相对较大，而低温对愈伤组织中的淀粉酶基因表达有增强作用，其中对β-淀粉酶基因B1的影响最为明显。甘薯愈伤组织高温-水涝总体上使3种淀粉酶活性呈下降趋势，其中淀粉酶A2和B1变化幅度相对较大。低温-水涝对3种淀粉酶活性的影响与高温-水涝的情况相似。 利用PCR技术从甘薯新大紫(Ipomoea batatas Lam cv．Xindazi)基因组中扩增出预期大小的β-淀粉酶基因DNA片段(约3kb)。将该片段克隆至pMD-T载体，经酶切分析和序列测定显示，该片段长2914bp，限制酶BamHI，BglⅡ，EcoRV，SacⅠ，SalⅠ，XbaⅠ，XhoⅠ在片段中各有1个酶切位点，EcoRI有3个酶切位点，无HindⅢ，KpnⅠ酶切位点。对克隆的β-淀粉酶基因进行序列分析然后与甘薯另一品种(Ipomoea batatas Lam cv．Kokei No.14)的核苷酸相比，有99.1％的序列相同，但新大紫的β-淀粉酶基因共有8处碱基变异，集中在第Ⅵ外显子中。