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SARS病毒RdRp基因的RNA干扰研究

王刚  
【摘要】:严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)是1种传染性强、病死率高的疾病,目前尚无公认的有效治疗方法。其病原体已被确认为冠状病毒的1个变种,称为SARS冠状病毒。RNAi(RNA interference,RNAi)可以高效、特异地下调靶基因的表达,不仅是研究基因功能的有力工具,而且为特异性基因治疗提供了新的技术手段。能有效抑制靶基因表达的siRNA(small interfering RNA)正在被开发成新型特异性药物,用来治疗病毒感染性疾病、肿瘤以及遗传性疾病等。本研究的目的就是针对SARS病毒筛选出高效、特异的siRNA,为进一步的药物研发奠定基础。 生物信息学分析结果表明,RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)基因是SARS病毒基因组中最保守的基因;在病毒的所有蛋白质中,RdRp是最重要的蛋白质,是病毒复制增殖所必需的酶。因此,本研究选择SARS病毒的RdRp基因为RNAi的靶基因。我们首先设计了1种安全、高效而可靠的方法来合成该基因:根据DNA shuffling技术的原理和SARS病毒RdRp基因的序列,设计并合成了多条寡核苷酸片段,每个片段末端都两两互补,从而在PCR过程中相互延伸,最终精确地组装成RdRp基因。所得基因的序列与预期设计完全吻合。 利用pcDNA3.1(+)和pEGFP-C1载体构建了3类真核重组表达质粒,并以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)作为标记基因。构建的表达质粒包括:1)分别表达RdRp和EGFP基因的质粒:pcDNA-RdRp(pcDNA-R)和pcDNA-EGFP(pcDNA-G)。转染Vero E6细胞后,pcDNA-G可表达明显的绿色荧光蛋白;2)表达RdRp和EGFP融合基因的质粒:pcDNA-GR和pcDNA-RG,pEGFP-CR1和pEGFP-CR2。转染Vero E6细胞后,前2个质粒表达的蛋白质荧光


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