重组腺病毒介导人TIMP-1基因抑制肝癌侵袭和转移的实验研究
【摘要】：目的 肝癌细胞对细胞外基质(ECM)的降解是导致肝癌生长、浸润及转移的重要因素，而基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制因子(TIMPs)在此过程中起着关键作用。本实验通过构建携带人TIMP-1全长cDNA的重组腺病毒AdhTIMP-1，作用于人肝癌细胞株以及肝癌地位模型，探讨其抑制人肝癌细胞侵袭和转移的作用机制。
方法 从人肝细胞癌(HCC)组织中提取总RNA，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)合成人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(hTIMP-1)全长cDNA。测序正确后将其正向克隆到腺病毒载体AdEasy~(TM)系统中穿梭质粒pAdTrack-CMV的多克隆位点(MCS)，与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，经HEK293细胞包装生成携带人TIMP-1的重组腺病毒AdhTIMP-1。用感染复数(MOI)为100的AdhTIMP-1转染人肝癌细胞株(HepG2)：PCR鉴定重组病毒；荧光计数测定重组病毒滴度；Western Blot检测培养液上清中TIMP-1蛋白的表达；半定量RT-PCR检测TIMP-1 mRNA在不同培养时相下的表达；透射电镜观察细胞超微结构变化；MTT实验及生长曲线监测细胞的生长和增殖；Boyden Chamber检测细胞体外侵袭人工基底膜(Matrigel)的能力；裸鼠成瘤实验观察AdhTIMP-1对裸鼠移植性HCC的影响以及抗肿瘤转移的作用；抗CD34单克隆抗体检测肿瘤组织中微血管密度(MVD)判断微血管对肿瘤恶性进程的影响。
结果 构建携带人TIMP-1全长cDNA的重组腺病毒AdhTIMP-1，
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