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小麦醇溶蛋白载体材料及其肝靶向给药系统的研究

王昶光  
【摘要】: 靶向给药系统载体材料一直吸引着医药工作者的极大兴趣。其中纳米粒子以其特有的优点更是近年来国内外一个极为重要的研究热点。目前已报道用于制备纳米粒子靶向药物系统的载体材料包括:合成的可生物降解的高分子聚合物体系和天然高分子体系。前者如聚a-氰基丙烯酸烷酯、聚乙烯醇、聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物等;后者如白蛋白、明胶、多糖等。而近年,植物来源的高分子蛋白类材料在制备纳米靶向给药系统方面显示出更大的优势,植物源蛋白具有能够包埋多种活性物质、不会被朊病毒(Prion)所污染、药理惰性和无毒等优点,有望成为合成类聚合物的优良替代品。 本课题拟制备一种新型植物源蛋白载体材料小麦醇溶蛋白并进行药物包载研究,以求开发出一种新型靶向给药系统的载体材料。课题主要分为以下几个部分进行:小麦醇溶蛋白载体材料的提取纯化与相关性质研究;小麦醇溶蛋白载体材料的生物安全性初步评价;小麦醇溶蛋白纳米粒的制备及包裹不同性质药物的研究;水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米粒的制备工艺及制剂学性质研究;水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米粒大鼠体内的药动学研究及小鼠体内组织分布研究。 首先,以脱脂前后重量及脱脂溶剂吸收值的变化为指标,通过单因素考察,最终确定了小麦面筋粉的脱脂工艺;以蛋白提取率为指标,确定了小麦醇溶蛋白的提取工艺;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测小麦醇溶蛋白分子量组成,确定了纯化工艺;同时对小麦醇溶蛋白的溶解性,蛋白分子量组成进行了考察。结果通过最佳提取纯化工艺得到的小麦醇溶蛋白为白色结晶状固体粉末,电泳显示其分子量组成为45-30kD,为一组结构相近的蛋白质,易溶于70%乙醇溶液,在水及其他有机溶剂中的溶解度急剧下降。 其次,对得到的小麦醇溶蛋白进行生物安全性的初步评价。以ECV-304脐静脉内皮细胞为模型,采用MTT法考察了小麦醇溶蛋白的细胞毒性;按照美国药典医药用辅料的安全性评价方法对小麦醇溶蛋白的溶血及初步的血液相容性进行考察研究;以小鼠为模型,考察了小麦醇溶蛋白的急性毒性。结果小麦醇溶蛋白不同浓度浸提液和二甲亚砜溶液对脐静脉内皮细胞的毒性为0级和1级,细胞的生长状况良好,形态未见异常。表明小麦醇溶蛋白对脐静脉内皮细胞无毒性作用。小麦醇溶蛋白的血液相容性良好,具有较弱的抗凝作用,溶血率为2.11%。急性毒性实验结果表明其LD_(50)值为96.7586 mg/ml(1.935g/kg),95%可信限C.L=106.3950-87.9352 mg/ml。 以小麦醇溶蛋白为载体材料制备空白纳米粒,并对制备工艺进行了初步考察;通过方法学考察确定了以沉淀法测定载药纳米粒的包封率、载药量;分别选择三种不同性质的中药抗肝炎有效成分水飞蓟素、淫羊藿苷及胡黄连苷Ⅱ进行包裹实验。通过试验结果分析,小麦醇溶蛋白载体材料可采用去溶剂化法制备载药纳米粒,形成的纳米粒内部为醇溶蛋白疏水基团组成的疏水内核,因此可以为脂溶性药物提供包载空间,药物结合或以疏水键吸附于纳米粒疏水内核中,而对于水溶性药物包载效果较差,药物主要以表面吸附的形式存在于纳米粒表面。因此,小麦醇溶蛋白对水飞蓟素的包裹效果较好,可以达到78.85%±7.53%的平均包封率。 对于该载体材料的研究本课题最终选择抗肝炎有效单体成分水飞蓟宾为模型药物制备载药纳米粒,采用星点设计-效应面法优化SN-GNPs的制备工艺,以包封率(entrapment efficiency,EE%)、载药量(dug loading,DL%)及综合指标(Overall desirability,OD)OD值为评价指标,确定了药物/载体比、乳化剂浓度及稳定剂用量等三个显著因素的最佳值。采用最佳工艺制备的SN-GNPs粒径、包封率、载药量分别为164.9nm、68.95%、4.79%。以外观、色泽、再分散性等为指标,优选了SN-GNPs冻干剂的处方,最终选择3%Glu与2%Man搭配使用为SN-GNPs的冻干支架剂。SN-GNPs体外释放实验结果表明,载药纳米粒在释放介质中的释放行为与空白药物相比呈现明显的缓释效果。 以水飞蓟宾注射液为参比制剂,考察了SN-GNPs在大鼠体内的药动学。采用DAS2.0软件对测定结果进行处理,确定最佳房室模型,通过房室模型及统计矩法求算药动学参数,结果表明,SN注射液及SN-GNPs在大鼠体内的药物动力学过程均符合二室模型。对主要的药动学参数进行统计学检验,结果表明飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米粒与对照药相比具有延长体内平均滞留时间的作用,表明SN-GNPs具有一定缓释的作用。 选用小鼠为动物模型,考察了静注SN及SN-GNPs的体内分布特征,统计学结果表明,SN-GNPs给药后与SN对照药物相比,延长了水飞蓟宾在肝中的滞留时间,增加了药物的肝脏分布,具有一定的肝靶向性。 本课题制备了可作为血管内靶向给药系统载体材料的小麦醇溶蛋白,并首次对其作为血管内给药材料进行了安全性的初步评价,选用不同药物考察了小麦醇溶蛋白作为载体所适合包裹的药物性质及载药机理,最终选用抗肝炎单体成分水飞蓟宾进行包载研究,并进行了体内外的相关评价,证实小麦醇溶蛋白作为新型给药系统载体材料的可行性。国内外未见相关报道。本课题为靶向给药提供了新的天然高分子材料,丰富载体材料的研究内容,具有一定的实用性和创新性。


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