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mBD2与HA1融合基因真核表达载体的构建及其免疫保护性研究

朱元军  
【摘要】: 目的 甲型流感病毒曾在世界上多次发生大规模的流感暴发流行,目前对流感尚无特效药物进行治疗,接种流感疫苗是易感者预防流感的最佳选择,核酸疫苗是当前流感疫苗研究的方向与热点。流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)是流感病毒的主要保护性抗原,能刺激机体产生中和性抗体,此类抗体具有中和病毒和防止病毒进入靶细胞的作用,可中断病毒的复制。HA由HA1重链和HA2轻链相连构成。HA的5个抗原决定簇主要都位于HA1区,因而流感亚单位疫苗的靶标就首选HA1区。小鼠β-防御素2(mBD2)是一种内源性的抗菌肽,对非成熟的DC细胞具有趋化作用,能活化APC,增强机体的免疫作用,因此可以作为一种天然的免疫佐剂。 本研究的目的在于构建mBD2与HA1融合的真核表达载体(pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1),并检测其在HEK293细胞中的表达,观察pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1免疫小鼠后对流感病毒攻击的保护力,研究mBD2作为免疫佐剂的可行性。 方法 用PCR技术分别从构建好的质粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中扩增出mBD2与HA1基因片段,再用重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将mBD2与HA1通过一段柔性多肽接头Gly_4Ser融合为mBD2—HA1。将mBD2—HA1融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转化感受态E. coli JM109并筛选阳性克隆。经酶切、PCR和测序鉴定正确后,用脂质体将重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1转染HEK293细胞,用课题组制备的兔抗流感病毒血清作为一抗,FITC荧光素标记的羊抗兔IgG为二抗,通过免疫荧光检测融合蛋白的真核表达情况。为了研究重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1对甲型流感病毒的免疫保护作用,我们以SPF级BALB/c小鼠为实验动物,用pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1、pcDNA3.1(+)/HA1和pcDNA3.1(+)质粒DNA分别免疫小鼠,一共免疫两次,每次间隔三周。在第二次加强免疫前,用断尾法从小鼠尾部取血;第二次免疫后10d(病毒攻击后3d),再次取血,并收集血清检测抗-HA抗体。加强免疫后一周,用致死量(10×LD50)滴鼻攻击小鼠,观测动物的体重变化及存活率。综合以上几个方面评价重组质粒的免疫保护效果。 结果 PCR法分别从质粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中扩增出了mBD2与HA1基因片段,并且用重叠延伸PCR法成功将mBD2与HA1通过一段柔性多肽接头Gly_4Ser融合为mBD2-HA1。重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1经双酶切电泳后出现大小约1.2kb的目的条带,PCR鉴定也出现了相同大小的条带,目的片段经测序和将测序结果进行Blast比对,证实了克隆片段是正确的。免疫荧光检测结果表明重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1体外实验能够在HEK293细胞中表达mBD2-HA1的融合蛋白。动物实验结果表明,pcDNA3.1(+)空质粒对照组的小鼠7d内全部死亡,pcDNA3.1(+)/HA1免疫组的小鼠保护率为50%,而pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1组的小鼠保护率为90%;与单独免疫pcDNA3.1(+)/HA1相比,mBD2-HA1融合基因DNA免疫小鼠后,诱导出了更高的抗-HA抗体,保护率也更高,并且体重丢失明显减少。 结论 综上所述,本研究成功构建了mBD2—HA1融合基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1,该质粒能在真核细胞中表达融合蛋白;经动物实验表明,pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1重组质粒DNA免疫实验动物后,能够为抗流感病毒攻击提供很好的保护力,其保护效果明显高于pcDNA3.1(+)/HA1免疫组。本研究结果初步表明:小鼠β防御素2可以作为一种免疫佐剂用于流感病毒的DNA疫苗中。


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