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K562/imatinib耐药细胞株的建立及其生物学性状的初步研究

高秋英  
【摘要】: 研究目的: 1.体外建立K562/imatinib耐药细胞株并对其生物学特性初步探讨 2.研究其可能的耐药机制,为肿瘤耐药的研究提供实验室条件 研究方法: 1.K562耐药细胞耐药克隆建立:以伊马替尼(imatinib)浓度梯度递增法诱导K562细胞耐药。极限稀释法克隆筛选,建立耐药细胞株。 2.K562R的生物学特性分析:24孔板培养K562R和K562S,绘制细胞生长曲线。MTT法检测不同浓度组的伊马替尼对K562S和K562R耐药性。 3.K562R耐药机制的初步分析:PCR技术扩增BCR-ABL融合基因及mdr1多药耐药基因。测序分析ABL酪氨酸激酶区有无点突变。流式细胞术检测P-gp表达。 研究结果: 1.KS62R的克隆纯化和生物学特性分析:极限稀释法成功克隆筛选出6株K562/imatinib纯化细胞株,其能长期存活于5μmol/L的伊马替尼培养液中。 细胞生长曲线显示5μmol/L伊马替尼作用于K562R细胞120h,活细胞数量与0h活细胞数量相比呈指数递增。6个浓度梯度的伊马替尼(0、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0μmol/L)作用于K562S细胞24h,发现所有浓度(0浓度除外)伊马替尼均可明显抑制K562S细胞的生长,24h细胞活力几乎为零。 MTT法抑制率测定K562S细胞IC50为0.67±0.09μmol/L,K562R细胞约为10.17±0.85μmol/L,耐药倍数约为15倍,细胞耐药性明显增加,各耐药细胞株间IC50无显著性差异。 2.K562R耐药机制的初步分析: 巢式PCR检测K562R及K562S细胞株均有1579bp及863bp大小BCR-ABL融合基因表达,863bp目的基因序列测定未发现点突变。 RT-PCR检测发现一株耐药细胞mdr1表达阳性,流式细胞术检测其P-gp弱阳性,两者具有一致性。 初步结论: 1.体外成功建立K562/imatinib耐药细胞株6株,平均耐药浓度为10.17±0.85μmol/L,耐药倍数约为15倍,耐药性明显增加。各耐药细胞株间IC50无显著性差异。 2.多药耐药基因(mdr1)及其编码蛋白P-pg参与了K562R-6的耐药机制。 3.BCR-ABL激酶区序列测定未发现点突变,其耐药机制有待于更进一步的研究。


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