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大鼠牙囊细胞体外培养方法的改良及生物学特性的初步研究

叶国  
【摘要】: 牙囊是包绕于成釉器及牙乳头外周的一层疏松结缔组织,起源于外胚间充质,具有多向分化潜能,其通过上皮—间充质反应分化形成牙周膜、牙骨质和固有牙槽骨。牙囊细胞以其较强的增殖分化能力成为牙周组织工程研究的一种种子细胞。 目前国内对大鼠牙囊细胞的研究尚集中于体外培养方法的探索及生物学特性研究阶段,本研究在国内外学者研究的基础上对大鼠牙囊细胞体外培养方法进行改进,旨在建立一种简便、快速培养大鼠牙囊细胞的方法,并从胶原、骨桥蛋白和骨钙素的表达等方面研究大鼠牙囊细胞的的生物学特性。 一、大鼠牙囊细胞分离、培养及传代 本研究采用“牙囊直接剥离法”与“胶原酶、胰酶交替消化法”相结合的方法代替传统的“两步消化法”,即:无菌条件下直接从牙胚表面剥离牙囊组织,剪成1mm~3大小的组织块,先用0.2%Ⅰ型胶原酶37℃水浴振动消化1小时,再加入0.25%胰蛋白酶继续消化5分钟(两次加入的消化液体积比为3:1),从而获得细胞悬液,离心后加入含15%胎牛血清的DMEM培养液,在含5%CO_2的37℃饱和湿度条件下进行原代培养。 通过这种方法,细胞悬液在12小时后,大部分细胞贴壁,原代培养6—7天长满约80%,即可进行传代,而传统方法则需2周时间,从而提高了效率。细胞形态上呈非均质性,存在多种细胞形态,其中以多角形和长梭形为多见,有两个或多个树突,具有成纤维细胞的形态特征,而且随着培养时间的延长,部分细胞胞浆中可见高密度颗粒的存在。 二、大鼠牙囊细胞的生物学特性分析 取生长良好的第4代牙囊细胞制作细胞爬片,通过细胞免疫组化染色,从波形蛋白、角蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白和骨钙素的表达来分析大鼠牙囊细胞的生物学特性。 免疫组化染色结果显示:波形蛋白表达阳性,呈棕黄色,定位于胞浆,细胞核则深染为蓝色,而角蛋白表达阴性,除了细胞核为蓝色外,胞浆不着色,证明细胞来源于外胚间充质;Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达均呈强阳性,说明牙囊细胞具有成纤维特性;骨桥蛋白和骨钙素的表达也呈阳性,与活体组织原位杂交的实验结果相符合,表明牙囊细胞具有合成矿化组织的能力。 综上所述,该方法能够快速获得原代大鼠牙囊细胞,且操作简便、易掌握,并从成纤维特性和细胞矿化特性两方面较全面的研究了大鼠牙囊细胞的生物学特征,并由此推测体外培养的大鼠牙囊细胞具有向牙周膜成纤维细胞和成骨/成牙骨质细胞分化的潜能,为其作为种子细胞在牙周组织工程中的应用进行了基础的研究。


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