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常染色体三个miniSTR同步检测和mt-SNP的微测序检测研究

杜冰  
【摘要】: 目的DNA降解检材的检测是当前法庭科学面临的重要挑战,miniSTR技术和线粒体DNA检测是目前解决这一难题的重要途径和研究热点。miniSTR技术可望显著提高DNA降解检材的检测成功率,但由于其扩增片段大小受限于STR重复序列的长度,导致仍有部分严重降解的检材无法检测;mtDNA检测可用于核DNA无法检测的检材,但尚存在个人识别力低的不足。本课题旨在:①建立新的miniSTR荧光标记复合扩增检测系统,为检测降解DNA样本提供有效手段。②筛选成都汉族群体中具遗传多态性的mt-SNP位点,在此基础上建立多重mt-SNP的微测序检测方法,提高mtDNA的个人识别能力,为快速、高通量的mt-SNP检测打下基础。 方法通过检索数据库,筛选出适宜的miniSTR基因座,进行群体遗传学研究,建立miniSTR荧光标记复合扩增检测系统,应用毛细管电泳和荧光标记自动分型系统检测扩增产物。依据国际DNA分析技术工作组(TWGDAM)的指导方案,对miniSTR复合扩增系统的灵敏度、基因座的种属特异性、案例应用、降解模型、陈旧血痕等法医学应用进行研究。在mt-SNP数据库中选择在其他群体具有多态性的709、6455、8020、8964、10398、12705、12771、14569、15043等9个mt-SNP位点,通过片段长度差异等位基因特异性PCR(FLDAS-PCR)技术对成都汉族群体进行了群体遗传学研究,获得具有多态性的六个mt-SNP位点,建立相应的复合PCR体系,采用SNaPshot试剂盒进行复合微测序反应并用美国ABI 310遗传分析仪进行分析检测。 结果成功构建了D1S1676、D6S1274和D17S1299的miniSTRs荧光标记复合扩增检测系统(3plex-miniSTR系统)。经法医学应用性研究显示:3plex-miniSTR系统的检测灵敏度为0.5ng模板DNA并有较高的种属特异性;通过6个实际检案证明,该体系能用于法医学个人识别和亲权鉴定;通过对陈旧血痕和降解模型的研究证明,该体系对降解检材有良好的扩增效果,较常规试剂盒扩增成功率高,可用于降解样本的分型。 采用FLDAS-PCR技术获得了成都汉族群体9个mt-SNP位点的群体遗传学数据,在140个无关个体的样本中检出了12种单倍型,单倍型变异度为0.7638。采用SNaPshot试剂盒,成功地建立了709、6455、10398、12705、14569、15043等6个mt-SNP位点的复合扩增及复合微测序方法。 结论本课题按照miniSTR引物设计策略,成功地构建了3个常染色体miniSTR基因座的复合扩增系统,能够在激光诱导荧光毛细管电泳自动分型的检测平台上运用,获得可靠的遗传学数据。该系统具备了法医学实践应用的可行性,为分析降解DNA检材提供了一种有效的新方法。 采用FLDAS-PCR技术筛选出在成都汉族群体具遗传多态性的6个mt-SNP位点,观察到12种单倍型,为比较不同群体间的数据提供了基础。采用SNaPshot试剂盒建立了多重mt-SNP的微测序检测方法,可用其对mtDNA进行快速、高通量检测,提高了mtDNA的个人识别能力,为骨骼、毛发等样本的检测提供了一种新的检验途径,其法医学应用尚需作进一步研究。


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