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内皮素1在体外对喉癌HEP2细胞影响的实验研究

徐定远  
【摘要】: 内皮素家族有三种异构体:内皮素1、内皮素2、内皮素3,其中内皮素1的生物学活性最为多样,研究也最充分。现已明确内皮素1是含21个氨基酸的活性肽,与G蛋白偶联受体A或者受体B受体结合后,可激活不同的信息通路,最终可发挥其生物学效应。研究表明,内皮素1的生物学效应非常复杂,对气道张力、离子运输、神经传递、垂体功能、基因调控等均发挥影响。 最近又发现内皮素1对多种恶性肿瘤的病理发展同样具有调控作用。国外多项研究证实,恶性肿瘤组织或者培养的肿瘤细胞存在内皮素1或者受体的表达;在内皮素受体的介导下,内皮素1可以通过促进细胞增殖、抑制凋亡、促进血管生成、促进细胞周围侵润及远处转移等多种方式,促进肿瘤的发生及发展。 喉癌是头颈部肿瘤中的高发疾病,占头颈部肿瘤的13.9%,我国部分地区发病率约为1.5-3.4/10万人,已成为严重威胁人民生命健康和生活质量的疾病。相对于其它恶性肿瘤,内皮素1与喉癌病理发展之间关系的研究并不充分,国外仅Shichiri等初步研究发现内皮素1可以促进喉癌细胞数量的增长,但恶性肿瘤的发生发展与细胞增殖、调亡、移行能力等密切相关,在喉癌病理发展过程中,内皮素1在上述方面的具体作用仍然缺乏深入了解,这正是本课题拟予解决的。 目的 1.明确内皮素1、内皮素受体在喉癌细胞中表达情况。 2.了解内皮素1对喉癌细胞增殖的影响。 3.了解内皮素1对喉癌细胞移行能力的影响。 4.了解内皮素1对喉癌细胞凋亡的影响。 方法 1.RTPCR方法检测内皮素1、内皮素受体A、内皮素受体B在人喉癌HEP2细胞的基因表达;通过免疫组化ABC法研究内皮素1、内皮素受体A、内皮素受体B在人喉癌HEP2细胞爬片的蛋白表达。 2.细胞种植于96孔板(2×10~3细胞/孔),5个浓度的内皮素1(1×10~(-7)mol/L,1×10~(-8)mol/L、1×10~(-9)mol/L、1×10~(10)mol/L、1×10~(-11)mol/L)分别处理人喉癌HEP 2细胞,MTT方法检测24小时、48小时、72小时、96小时的吸光度,观察内皮素1能否促进细胞增殖。 3.按300个细胞/孔密度,将HEP2细胞接种于24孔板,3个浓度内皮素1(1×10~(-7)mol/L、1×10~(-9)mol/L、1×10~(-11)mol/L)干预细胞48小时后,继续培养10天,观察克隆生成情况。 4.按3×10~5细胞/孔密度,将HEP 2细胞接种于6孔板,3个浓度内皮素1(1×10~(-7)mol/L、1×10~(-9)mol/L、1×10~(-11)mol/L)分别处理细胞48小时,采用划痕实验方法观察内皮素1对喉癌细胞移行能力的影响。 5.3个浓度内皮素1(1×10~(-7)mol/L、1×10~(-9)mol/L、1×10~(-11)mol/L)分别处理细胞24、48小时后,观察喉癌细胞凋亡指数的变化。 结果 1.人喉癌HEP2细胞采用内皮素1、内皮素受体A、内皮素受体B和GAPDH引物进行PCR,均获得阳性目的片断,与预期片断长度符合。内皮素1扩增片断长度为129bp,内皮素受体A扩增片断长度为175bp,内皮素受体B扩增片断长度为130 bp,GAPDH扩增片断长度为141bp。 2.光学显微镜下观察,人喉癌HEP 2细胞浆内见内皮素1棕黄色免疫反应颗粒沉着;内皮素受体A、内皮素受体B亦见免疫阳性反应,免疫反应主要分布于细胞膜。 3.MTT法显示,1×10~(-7)mol/L浓度内皮素1作用喉癌HEP 2细胞后,可以明显促进喉癌HEP 2细胞增殖,而1×10~(-11)~1×10~(-8)mol/L浓度组的内皮素1对喉癌细胞HEP 2的增殖没有作用。 4.内皮素1干预喉癌HEP 2细胞48小时,并继续培养十天后,内皮素1(1×10~(-7)mol/L浓度)处理组细胞集落体积大,细胞克隆数为59.0±2.00;1×10~(-9)mol/L浓度组克隆数为32.6±1.15,1×10~(-11)mol/L浓度组克隆数为30.6±2.08,对照组为31.0±1.00。内皮素1(1×10~(-7)mol/L浓度)组与对照组比较,有显著性差异。 5.1×10~(-7)mol/L、1×10~(-9)mol/L、1×10~(-11)mol/L浓度内皮素1处理细胞48小时后,明显促进喉癌HEP 2细胞的移行,其中对照组移行细胞数为8.00±1.00,内皮素1各处理组(1×10~(-7)mol/L、1×10~(-9)mol/L、1×10~(-11)mol/L)分别为21.6±1.57、17.3±1.52、15.6±2.08,与对照组比较,各个内皮素1浓度组均有显著性差异。 6.流式检测显示,内皮素1处理24、48小时后,各内皮素1浓度组与对照组、各内皮素1浓度组间细胞凋亡率(AI)均无显著性差异。 结论 1.人喉癌HEP 2细胞存在内皮素1、内皮素受体A和内皮素受体B基因及蛋白表达。 2.内皮素1可以促进人喉癌HEP2细胞增殖,并且与内皮素1的浓度高低相关。 3.内皮素1对人喉癌HEP 2细胞移行有促进作用。 4.内皮素1对人喉癌HEP 2细胞的凋亡没有影响。


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