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铬离子对人成骨样细胞株MG63的毒性与其氧化应激关系的实验研究

付俊  
【摘要】: 氧自由基生物学是一门新兴的学科,目前的研究发现氧自由基参与许多疾病的发病机制,抗氧化剂又可用于许多与氧自由基损伤有关的疾病的防治,具有重大的实用性。因而自由基生物学与医学紧密相联,成为一个十分活跃的研究领域。口腔慢性炎症性疾病和骨吸收相关的病理过程都有氧自由基的参与。 牙缺损或缺失后常用金属或包含金属的材料进行修复。非贵金属材料因价格便宜,又具有良好的机械性能,在临床上广泛运用。临床上经常可以看到戴用修复体一段时间后出现牙龈着色、增生、红肿乃至局限性牙周炎或种植体周围炎的发生。在各种影响修复体周围组织健康的因素中,修复用合金的影响受到越来越多的关注。这些合金在口腔潮湿环境缓慢释放出金属离子,一定浓度的金属离子对口腔软硬组织可产生毒性作用。近年的研究发现,大多数过渡金属离子可能影响单核细胞、成纤维细胞等多种细胞内氧化还原反应,引起细胞的氧化应激,进而影响细胞的形态、增殖和分化。成骨细胞是参与骨重建的重要细胞,成骨细胞的功能状态是影响牙周健康的重要因素。有关金属离子对成骨细胞的毒性作用以及与氧化应激之间关系的研究,目前尚未见报道。铬离子是修复用生物合金的基本组分之一,铬与许多疾病和损伤密切相关。铬离子的生物毒性机制是否与刺激组织细胞产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),引起氧化应激有关,是学者们的研究热点,但具体机制仍不十分清楚。本课题针对相关内容,以人成骨样细胞株MG63为研究对象,分三部分进行了探讨。 1氧化应激对人成骨样细胞MG63活性的影响 利用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(xanthine/xanthine oxidase,X/XO)的酶促反应生成超氧阴离子自由基刺激MG63细胞,成功建立了成骨细胞氧化应激模型,运用氧化敏感性荧光探针DCFH-DA结合流式细胞术检测了细胞内ROS的生成,用倒置显微镜和MTT实验观察研究氧化应激对成骨细胞形态和增殖活力的影响。结果发现,X/XO处理后细胞形态发生明显破坏,细胞增殖活力明显降低,且随处理浓度增大、时间延长,细胞内ROS的生成量越大,细胞增殖活力降低更明显。XO的抑制剂Oxypurinol在抑制细胞内ROS产生的同时,也拮抗了X/XO引起的成骨细胞毒性。提示氧化应激可以破坏成骨细胞形态,抑制成骨细胞增殖活力。 2铬离子对人成骨样细胞MG63的毒性作用 5-20μM的Cr~(6+)和Cr~(3+)刺激MG63细胞,定量研究不同价态的铬离子对MG63细胞的毒性作用。用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine,NAC)预处理细胞,观察它们对铬离子引起的成骨细胞毒性作用的拮抗效应。结果发现,Cr~(6+)对MG63细胞具有明显的细胞毒性,抑制成骨细胞增殖活力和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,破坏细胞正常形态和亚结构。Cr~(3+)对MG63细胞的活性没有明显的影响。1-5mM的抗氧化剂NAC可以抑制Cr~(6+)引起的成骨细胞毒性。为进一步研究氧化应激在铬离子引起的成骨细胞毒性机制中的作用提供相应的实验基础。 3铬离子作用下的人成骨样细胞MG63的氧化应激 用5-20μM的铬离子对MG63细胞染毒,氧化敏感性荧光探针DCFH-DA结合流式细胞术及MDA实验检测不同价态、不同浓度铬离子对MG63细胞内ROS生成的影响和细胞脂质过氧化损伤程度。结果发现:5-20μM Cr~(6+)染毒1h后细胞内ROS的生成明显增加,高浓度组比低浓度组ROS生成更多;10μM Cr~(6+)染毒15-120min,引起MG63细胞内ROS的大量生成,且随着染毒时间的延长,细胞内ROS的生成量也越多;5-20μM Cr~(6+)染毒24h和72h引起MG63细胞脂质过氧化损伤,Cr~(6+)浓度越高、染毒时间越长,细胞脂质过氧化损伤程度越高;1-5mM的抗氧化剂NAC可以抑制Cr~(6+)引起的MG63细胞内ROS的产生和脂质过氧化损伤;5-20μM的Cr~(3+)对MG63细胞内ROS的生成和脂质过氧化损伤程度无明显影响。上述结果提示,Cr~(6+)刺激MG63细胞内ROS大量生成,引起细胞的氧化应激;抗氧化剂NAC可以抑制Cr~(6+)引起的MG63细胞氧化应激性损伤。 综上所述,本实验的研究结果显示,Cr~(6+)对人成骨样细胞MG63具有明显的细胞毒性,其毒性机制与刺激细胞内ROS生成,引起成骨细胞氧化应激有关。结合自由基生物学相关理论和本实验的研究结果推测,Cr~(6+)引起细胞内ROS生成的原因可能是Cr~(6+)催化细胞内Fenton反应,引起最具损伤性的自由基·OH大量生成所致。


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