大黄酸及其衍生物二乙酰大黄酸对关节软骨损伤保护作用的实验研究

【摘要】： 目的： 1．研究关节软骨损伤后关节内组织中促炎症细胞因子和转录因子的变化，探讨创伤性骨关节炎的发病机理 2．研究大黄酸及其衍生物二乙酰大黄酸对关节软骨损伤后关节内和血清中促炎症细胞因子的表达的抑制作用，为其临床使用提供理论依据 方法： 1．通过6．3J，0．9J能量直接撞击兔膝关节软骨建立高能量组(H组)、低能量组(L组)关节软骨损伤模型。 2．通过酶消化法分离培养高能量、低能量撞击后和正常兔膝关节的透明软骨细胞，通过Trypan Blue染色、绘制细胞生长曲线观察创伤能量对软骨细胞生存能力的影响；用甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色检测软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原能力；用RT-PCR检测细胞中IL-1β和NF-κB mRNA表达水平：用ELISA方法检测细胞合成IL-1β和MMP-1的情况。用大黄酸、透明质酸钠、N-乙酰氨基葡萄糖对高能量损伤组软骨细胞进行干预，研究大黄酸对创伤后软骨细胞的治疗作用。 3．通过组织块培养法获取三组动物关节中的B型滑膜细胞，用RT-PCR检测细胞中IL-1β和NF-κB mRNA表达水平；用ELISA方法检测细胞合成IL-1β和MMP-1的情况，用大黄酸、透明质酸钠、N-乙酰氨基葡萄糖对滑膜细胞进行干预，研究这些药物对创伤后滑膜细胞的治疗作用。 4．将高能量组、低能量组和对照组动物于术后1，2，4，8，16，32取材，观察关节软骨损伤程度，滑膜组织反应，用番红O染色检测软骨中蛋白多糖含量：用免疫组化染色定位和定量软骨和滑膜组织中IL-1β和NF-κB的表达；ELISA定量检测关节液和血清中IL-1β和MMP-1水平。探讨炎症细胞因子的表达与软骨退变之间的关系。 5．几种药物对关节软骨损伤的保护作用研究：实验分为A，B，C，D，E组，A组：生理盐水组，B组：二乙酰大黄酸组，C组：塞来昔布组，D组：透明质酸组，E组：N-L酰氨基葡萄糖组。采用管喂和关节腔内注射方式给药4周，于术后1，2，4，8周分别抽取关节液和血清，用ELISA定量检测其中IL-1β和MMP-1水平；术后8周取关节软骨和滑膜组织，组织学观察其退变和炎性细胞浸润情况；番红O检测软骨中蛋白多糖含量；免疫组化染色定位和定量检测软骨和滑膜组织中IL-1β和NF-κB的表达。 结果： 1关节软骨损伤后，软骨细胞的存活率下降，原代细胞的贴壁细胞数量减少，贴壁时间延长，生长曲线下移，细胞甲苯胺蓝染色异染反应减弱，Ⅱ型胶原免疫组化染色强度减弱，软骨细胞中IL-1β和NF-κBmRNA表达水平上升，细胞培养液中IL-1β和MMP-1的含量升高，各组之间的变化程度为高能量组＞低能量组＞对照组，各组之间的差异明显(p＜0．05)。 2用大黄酸、透明质酸钠、N-乙酰氨基葡萄糖对高能量损伤组软骨细胞进行干预后，软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原的能力上升，细胞内IL-1β和NF-κB mRNA的表达及细胞培养液中IL-1β和MMP-1的含量降低，差异明显(p＜0．05)，且作用的强度与药物浓度存在剂量效应关系，药物浓度越高，作用效果越明显。 3体外培养关节软骨创伤后的B型滑膜细胞，IL-1β和NF-κB mRNA表达明显上调，细胞合成IL-1β和MMP-1能力的增加，采用大黄酸、透明质酸钠、N-乙酰氨基葡萄糖对所获得的B型滑膜细胞进行体外干预后，细胞中IL-1β和NF-κB mRNA表达明显下调(p＜0．05)，细胞合成IL-1β和MMP-1能力下降(p＜0．05)。 4高、低能量撞击后，关节液和血清中IL-1β和MMP-1含量均明显增高，与对照组相比有显著差异(p＜0．05)，低能量组在伤后4周IL-1β和MMP-1恢复到对照组水平，高能量组则始终保持在较高水平上。 5高、低能量撞击后软骨和滑膜组织中IL-1β和NF-κB的阳性表达均增强，低能量组主要集中在关节软骨的浅表层和滑膜组织的衬里层，4周后阳性细胞率与正常对照无明显差异(p＞0．05)。高能量组在关节软骨全层和滑膜衬里下层内均有阳性表达，在伤后时间越长，阳性细胞率越高，与低能量组和对照组之间均有显著差异(p＜0．05)。阳性细胞数目与软骨退变的程度一致。 6高能量撞击关节软骨，给于药物治疗后，各组关节液和血清中IL-1β和MMP-1含量均明显下降(p＜0．05)，软骨和滑膜组织中IL-1β和NF-κB的阳性表达均下降(p＜0．05)，在治疗后1～2周，以C、D、E组的作用较强，治疗4周后，B组的作用强度最强。8周后，各治疗组番红O染色提示软骨基质中蛋白多糖含量比A组明显增加(p＜0．05)，强度依次为B组＞C组＞D组＞E组＞A组。 结论： 1关节软骨损伤后，软骨细胞和滑膜细胞中IL-1β和NF-κB的表达增加，IL-1β和MMP-1的合成增加，与损伤能量的大小成正相关，与软骨细胞的生存能力和合成细胞外基质的能力成负相关，表明不同程度创伤后软骨细胞功能的受损程度与细胞因子IL-1β和MMP-1，转录因子NF-κB的表达相关。 2低能量损伤后关节软骨和滑膜表层细胞中IL-1β和NF-κB表达轻度升高，持续到伤后4周后恢复正常，不引起关节软骨的进行性破坏。 3高能量损伤后全层关节软骨和滑膜细胞中IL-1β和NF-κB mRNA的表达、关节液和血清中IL-1β和MMP-1含量均维持在较高水平，关节软骨进行性破坏，说明关节软骨受到高能量撞击后，软骨组织和细胞受到的损伤不能自行修复，引起关节软骨逐渐退变。 4 IL-1β和MMP-1的水平与关节软骨退变进程一致，其变化规律能够反映伤情的转归，NF-κB在关节组织内的活化程度与IL-1β和MMP-1表达的强度紧密相关。IL-1β、MMP-1和NF-κB可以反映关节软骨退变程度和治疗效果。 5大黄酸、透明质酸钠和N-乙酰氨基葡萄糖能够增加体外培养的受损软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原的能力，对软骨细胞的生长、增殖有促进作用，并且这种作用的强度与药物浓度存在剂量效应关系。同时，三种药物能有效降低受损软骨细胞和滑膜细胞中IL-1β、NF-κBmRNA水平和IL-1β、MMP-1的合成。 6二乙酰大黄酸、透明质酸钠、N-乙酰氨基葡萄糖、塞来昔布均能够抑制软骨细胞外基质的破坏，显著降低关节软骨损伤后关节内组织中IL-1β和NF-κB的表达，并降低关节液和血清中IL-1β和MMP-1的合成，抑制关节内的炎症反应。对防治创性骨关节炎的发生具有重要的临床意义。