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DN大鼠肾内小动脉早期骨基质蛋白的表达及非洛地平对其作用的实验研究

欧三桃  
【摘要】: 目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)的血管病变是DM的主要并发症,其大血管病变性质为动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS),主要累及主动脉、冠状动脉等大血管。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是DM的重要并发症,其发生、发展与糖尿病微血管损害有关。近年来发现血管钙化是进展性AS的普遍特征,是糖尿病患者发生心血管事件的重要预测因素。已有的研究表明DM患者较非DM患者更易发生血管钙化,而糖尿病伴发肾病者血管钙化更为普遍和严重。由于目前对DM血管钙化的实验研究多集中于冠状动脉、肾动脉等大动脉,对脏器内(如肾脏内)的小血管改变知之甚少。因此我们建立了链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的糖尿病动物模型,拟采用免疫组化、原位杂交及实时荧光定量PCR(real time polymerase chain reaction,Real-TimePCR)等方法,多时点动态观察糖尿病肾病肾内小动脉上与血管钙化密切相关的骨基质蛋白如核结合因子α亚单位1(core-binding factorα_1,Cbfa1)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、骨钙素(osteocalcin,OC)等的表达变化。旨在研究这些骨基质蛋白在肾脏中的变化规律,了解肾内小动脉有无血管钙化的发生,以及它们的改变是否参与了糖尿病肾脏的发生发展。同时观察长效非洛地平这一钙离子拮抗剂是否对DM的血管钙化有改善作用。 方法雄性成年SD大鼠,标准化喂养。设对照组、糖尿病组和非洛地平三组,每组4、8、12、16、24周5个观察点,每时点6~7只鼠。糖尿病组和非洛地平组采用STZ腹腔注射造模。造模成功后,干预组予长效非洛地平10mg/kg体重灌胃,每日一次。处死前留血、尿备测常规生化指标。肾脏石腊切片普通病理及茜素红染色观察肾内小动脉钙盐沉积情况。免疫组化半定量分析Cbfa1,OC,OPG蛋白水平的表达,mRNA原位杂交检测Cbfa1,OC,OPG mRNA在肾内的定位和表达变化。采用Real-Time PCR检测肾脏OC及OPG mRNA表达并分析各指标间相关性。 结果(1)免疫组化显示DN组各时点肾小球、肾小管均有Cbfa1的弱阳性表达,自第8周起,肾内小动脉中膜上Cbfa1表达逐渐增多,以第24周时表达最明显。原位杂交结果提示Cbfa1mRNA表达部位与Cbfa1蛋白表达部位一致,表达量自第8周开始升高,以后随病程进展表达逐渐上调,在24周时表达达峰值。而肾小球及肾小管、肾间质内表达较弱,且随时间进展变化不大。正常组有Cbfa1蛋白和mRNA的弱阳性表达,各时间点间无差异。(2)免疫组化示DN组第4~12周时肾脏未见OC的明确表达。第16周~24周时,可见在肾内小动脉上有OC的弱阳性表达。原位杂交示DN组第4~8周时肾内小动脉上无OC mRNA表达,第12周时出现OC mRNA的弱表达,第16~24周时表达进一步增强,表达部位与蛋白表达一致,肾小球及肾小管上无表达。Real-Time PCR结果提示DN组大鼠肾组织第4~12周无OC mRNA的表达,第16周开始出现OC mRNA的表达,第24周时亦有表达,两时间点无显著差异。正常组肾组织未检测到OC蛋白及mRNA表达。(3)OPG免疫组化提示DN组第4周时肾内小动脉上有OPG的弱阳性表达,自第8周时表达增多,12周时达峰值,第16周时表达开始下降,24周时更低。OPG原位杂交结果显示OPG蛋白与mRNA表达部位一致,DN组第4周时肾内小血管上OPG mRNA表达较弱,第8周起表达逐渐增强,12周时表达达峰值,第16周时表达开始下调,24周时进一步降低。Real-Time PCR结果示DN组不同时点OPG mRNA表达存在差异,第8周OPG mRNA表达开始上调,以12周表达最强,16周后表达逐渐下调,24周时更低。正常组肾组织有OPG蛋白和mRNA的弱表达,各时点无显著性差异。(4)Cbfa1,OPG,OC的表达变化与血磷、血脂、肾功及尿蛋白呈正相关,三者间Cbfa1与OPG和OC相关性较好,OPG与OC呈正相关。(5)给予非洛地平干预后,对血糖、血脂、血钙磷及尿蛋白无明显改善,对肾组织病理改变、钙盐沉积及Cbfa1,OC的表达无明显改善。仅OPG的免疫组化和mRNA原位杂交、Real-Time PCR提示在16~24周时,非洛地平干预组OPG表达高于DN组。(6)肾组织茜素红染色结果示正常组各时间点肾组织及肾内小动脉无钙化,糖尿病组及非洛地平组在第16~24周时肾内小动脉存在轻~中度钙化。 结论(1)糖尿病肾病肾内小动脉发生钙盐沉积前即已有Cbfa1,OC及OPG等骨基质蛋白的表达。(2) Cbfa1在糖尿病肾病肾内小动脉上表达持续上调,其后出现其下游蛋白OC的表达,并最终出现钙盐沉积,提示Cbfa1是糖尿病血管钙化的重要转录因子,也是血管钙化的早期生物学标志。(3) OPG在糖尿病肾脏早期表达上调,后期表达下调。早期表达上调可能为机体代偿性的保护机制所致,后期下调与促钙化因素如高血磷、高血脂的增强有关。(4) Cbfa1,OC及OPG的表达改变与尿蛋白增高、肾功能下降及血磷升高相关,提示肾内小动脉上这些骨基质蛋白的表达变化可能参与了糖尿病肾病的发生发展。(5)本模型中发现长效非洛地平晚期可上调OPG表达,但对糖尿病肾病肾内小动脉钙化及其他相关指标无明显改善作用。


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