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血管钙化相关因子在糖尿病鼠肾小动脉中的表达及其与血管内膜/中膜增厚关系的初步探讨

赵安菊  
【摘要】: 背景和研究目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的严重并发症之一,其基本病理改变公认为肾小球基底膜增厚、系膜基质增生,最终弥漫性或结节性肾小球硬化。糖尿病的血管病变如动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)和血管钙化(Vascular calcification)是糖尿病大血管并发症研究中的焦点,尸检发现肾动脉也有粥样斑块和钙化,但鲜有肾脏病理学家及肾脏病学家描述或研究肾实质内除肾动脉外的下级分支小动脉的血管钙化早期病灶及其相关因子表达以及这些因素在DM和DN发病机制中作用的报道。本文拟通过糖尿病动物模型,连续多时点观察核心结合因子a1(core bind factor alpha-1,Cbfa1)、骨形成蛋白2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、基质Gla蛋白(Matrix Gla Protein,MGP)以及单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)在糖尿病肾病鼠的肾脏实质小动脉中的表达,并探讨血管内膜/中膜增厚与血管钙化相关因子及炎性因子MCP-1的关系,旨在研究糖尿病肾病早期肾脏实质小动脉中血管钙化早期标志表达的变化规律,探讨血管钙化在糖尿病肾病发生发展中的作用,为糖尿病肾病的治疗提供新的思路和新的靶点。 方法雄性成年SD大鼠,标准化喂养。设糖尿病肾病、非洛地平干预和正常三组,每组4、8、12、16、24周5个观察点,每时点6~7只鼠,糖尿病肾病组采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔注射造模。处死前留尿、备血测常规生化指标,分析各指标的相关关系。采用原位杂交技术、免疫组织化学染色以及实时荧光定量(Real-time PCR)检测肾实质内小动脉Cbfa1、BMP-2、MGP和MCP-1的蛋白和基因的表达,免疫荧光组化观察内膜/中膜厚度比,肾脏石腊切片普通病理观察及茜素红钙特殊染色观察血管钙盐沉积的情况。 结果(1)Cbfa1免疫组化显示在DN组与DN-F组肾实质小动脉上有蛋白表达(小球上有微弱表达,小管上没有表达),于4周开始上调,随时间推移表达逐渐增强,24周表达最强,各时间点比较显著高于N组,N组小动脉有弱表达,各时间点无差异;Cbfa1原位杂交结果显示只在肾小动脉有mRNA表达,4周时有微弱表达,8周开始增强,主要表达于小动脉内弹力层和外弹力层,24周表达最强,16、24周小动脉肌层表达亦增强,各时间点比较显著高于N组,N组表达弱,各时间点无差异,DN组与DN-F组比较无显著差异。(2)MGP Real-Time PCR显示DN组与DN-F组4周表达量最高,8周稍降低,12周表达量稍有增加,16周后表达量显著降低,24周最低,且低于N组,N组各时间点表达量无显著差异。(3)BMP-2免疫组化显示在DN组与DN-F组肾实质小动脉有表达(小球上、小管有弱表达),4周表达上调,随时间推移表达逐渐增强,4、8周小动脉内弹力膜表达明显,肌层表达较弱,12周后肌层表达亦明显增强,24周达高峰,N组小动脉上无表达;Real-Time PCR显示在DN组与DN-F组各时点BMP-2 mRNA表达量存在差异,4周表达量开始增加,12周稍下降,16、24周表达量持续增加,24周达高峰,各时间点比较明显高于N组,N组内比较无差异;原位杂交显示在DN组与DN-F组BMP-2表达情况同Cbfa1原位杂交。(4)MCP-1免疫组化显示DN组与DN-F组在小动脉、小球及小管均有表达,小动脉4、8、12周表达无显著差异,16、24周表达明显上调,N组小动脉及小球没有表达,仅在小管有微弱表达;原位杂交显示DN组与DN-F组MCP-1小动脉上有表达,4周开始有表达,8周表达增加,16、24周达高峰,DN组与DN-F组各时间点比较无显著差异,N组肾小动脉无表达。(5)茜素红钙染色显示DN组与DN-F组早期(4、8周)肾实质小动脉上没有钙盐沉积,中后期(16、24周)可见点状甚至片状沉积。(6)免疫荧光组化可见肾内小动脉内膜呈红色荧光,中膜呈绿色荧光,第4周时,DN组及DN-F组内膜/中膜之比与N组无明显差异,第12周时DN组及DN-F组内膜/中膜之比高于N组,但无统计学意义,DN组与DN-F组间无显著差异。第24周时DN与DN-F组内膜/中膜之比高于N组,且有统计学意义。(7)DN组Cbfa1、BMP-2呈显著正相关,它们与血脂、血磷、血肌酐、尿蛋白也呈明显正相关;Cbfa1、BMP-2与MGP呈显著负相关,Cbfa1与MCP-1、血钙及尿素氮呈显著正相关;MGP与血脂、血磷、血肌酐、尿蛋白却呈明显负相关。BMP-2、MGP与MCP-1血钙及尿素氮无明显相关性。小动脉内膜/中膜之比与Cbfa1、BMP-2、MCP-1呈明显呈正相关;与CHOL、TG呈显著正相关;与血磷呈正相关;与血钙呈正相关,但无统计学意义。 结论1.糖尿病肾病早期肾脏实质内小动脉存在血管钙化的早期标志Cbfa-1的表达,且随病程延长,促进血管钙化因子BMP-2表达逐渐增强,抑制血管钙化因子MGP表达减弱;2.DN肾实质小动脉早期无钙盐沉积,中后期钙盐沉积逐渐增多;3.DN早期内膜/中膜厚度比无明显变化,中期已有变化,后期变化明显;4.血管钙化前已先有钙化形成相关因子MGP和BMP-2的表达,且MGP在血管钙化早期表达增加,晚期表达下降,BMP-2却在早期表达较弱,晚期表达增强,二者呈明显负相关,提示MGP/BMP-2确是一对调节血管钙化的并相互拮抗的因子;5.血管钙化指标与血脂、血磷、血肌酐及炎症因子MCP-1等有明显相关性,说明DN早期即存在的炎症状态(与内膜增厚相关)及代谢紊乱可以促进肾实质小动脉钙化。中膜增厚是否由MCP-1诱导,尚待进一步研究;6.本实验中长效非洛地平对DN早期肾实质小动脉钙化影响不明显。


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