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人外周血hPERIOD1相互作用蛋白的筛选

冀治鸿  
【摘要】: 自然界大多数生物的生理活动均呈现周期约24小时的节律变化,这些现象称为近日节律。哺乳动物近日节律中枢位于下丘脑视交叉上核(SCN),其产生的分子机制为一系列节律基因及其表达产物组成的转录和转录后调控所形成反馈环路。这些基因包括Per1,Per2,Per3,Cry1,Cry2,Bmall和Clock等。目前的研究发现,近日节律基因在一些外周组织,如肝、肾、肺等表达。Per1作为近日节律分子振荡的核心元件,在SCN中产生和维持起重要作用,在外周组织中也有丰富的表达。然而,迄今为止,外周组织PER1的功能尚不十分清楚。 为了完善hPer1在近日节律分子振荡的机制,本文采用酵母双杂交技术,以hPER1的bHLH-PAS结构域为诱饵蛋白对人血液cDNA文库进行筛选,寻找与其相互作用的新蛋白,为进一步研究hPer1的功能提供新的线索。 构建人血液cDNA文库。通过RT-PCR扩增hPER1-PAS结构域的编码序列,获得的片断与质粒载体pGBKT7连接重组为诱饵质粒pGBKT7/hPer1_(PAS)。检测转化诱饵质粒的酵母AH109是否有自激活发生以及重组诱饵蛋白的毒性。顺序转染法构建酵母双杂交系统,筛选人血液cDNA文库中能与诱饵蛋白hPER1-PAS结构域相互作用的蛋白。采用营养缺陷培养基、β-半乳糖苷酶印膜法检测报告基因的表达。阳性克隆经PCR扩增后,进行测序和生物信息学分析。 经酶切和基因测序鉴定证实重组诱饵质粒pGBKT7/hPer1_(bHLH-PAS)构建成功。自激活检测和毒性检测实验表明诱饵蛋白对酵母AH109无毒性作用。酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆。通过测序和生物信息学分析,其中之一能与PER1相互作用的蛋白为LSMD1。 利用酵母双杂交系统筛选了与PER1相互作用的新蛋白LSMD1。


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