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甘薯(Ipomoea batatas (L.) Lam.)的EST-SSR分子标记和遗传转化研究

罗红蓉  
【摘要】: 甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)是世界上位列第七位,仅次于小麦,水稻,玉米,马铃薯,大麦和木薯的重要农作物,但该作物的遗传研究却非常少。 首先,保存于国际马铃薯中心(CIP)的甘薯种质资源需要有效的遗传工具去鉴别和评价。另外许多甘薯的基础的问题仍不清楚,如甘薯的起源和驯化的确切中心,该种的祖先种,甘薯是同源多倍体还是异源多倍体,南太平洋群岛的甘薯来源等。 为了解决以上问题,我们构建了一套高信息量且易于鉴别的表达序列标签(EST)-简单重复序列(SSR)分子标记。EST微卫星标记是从甘薯的根和芽的表达序列标签中分离而来。共设计了25对SSR引物,对他们进行了筛选和测试其多态性和可转移性。其中的10对引物显示高质量扩增,高多态性,被用于种质鉴定。9对引物从甘薯和I.trifida中都扩增出了产物,表明SSR的侧翼序列不仅在甘薯(6X)中是保守的,在其近源二倍体中也如此。这9对引物共检测出了66个多态的等位基因,平均每个基因座7.33个。等位基因片段大小从169bp到393bp.相似系数从0.74至0.96。这些EST-SSR多态值从0.4230至0.8718,平均为0.7145.实际杂合度(He)在9个基因座间变动很大,从0.30(IB-S18)至0.99(IB-S10),平均为0.71。 该EST-SSR分子标记被用于对保存于CIP的甘薯基因库中农家种的多样性分析。从南美洲(秘鲁,厄瓜多尔,委内瑞拉和哥伦比亚),中美洲(墨西哥,尼加拉瓜,危地马拉和洪都拉斯)以及南太平洋群岛(巴布亚新几内亚,所罗门,汤加,斐济和库克)收集来的120个农家种进行多样性研究。总等位基因数和每个基因座的等位基因数在地区间分布是不均衡的。聚类分析揭示在中美洲和南太平洋群岛的基因池有很大遗传变异,远大于秘鲁-厄瓜多尔。而危地马拉的农家种与南太平洋群岛群组在一起。 从EST-SSR研究结果表明:1,甘薯是种间杂交的异源六倍体。2,I.trifida很可能是六倍体甘薯起源的二倍体祖先种之一:3,中美洲应该是甘薯起源中心:4,中美洲甘薯应该是南太平洋群岛甘薯的主要来源而不是来自于秘鲁-厄瓜多尔:5,一少部分南太平洋群岛甘薯仍与秘鲁-厄瓜多尔种质群组在一起,暗示了可能存在象“Kumara”假说所说的从秘鲁到南太平洋群岛的史前人类传播。由此可见,EST-SSR可成功应用于甘薯的种质资源管理,如更直接估计功能基因的多态性,基因型鉴定,分类学进化关系的研究。 由于复杂六倍体遗传背景和自交不亲和,使得甘薯基于有性杂交的传统育种非常困难。现代的遗传重组技术给甘薯的遗传改良带来希望。用根癌农杆菌转化甘薯开始于10年前,但高转化效率仍是主要的“瓶颈”问题。因此切需一个全新转化系统来提高转化芽的再生,且该方法应是快速而且基因型不依赖的。 首先研究了一个重要的非洲主栽品种的胚状体途径的再生,该品种在转基因研究中被发现是难于诱导胚性愈伤组织的。诱导条件优化后,在含有激素4-FA的cv.Tanzania的胚性愈伤发生率可达50%。但这些胚性愈伤的再生为植株的频率却低于10%。 我们又对8个中国主栽品种的转化效率进行研究,并试图通过胚状体途径再生转基因植株。用载有pSCL233质粒的根癌农杆菌菌株LBA4404,该质粒有人乳铁蛋白基因,转化甘薯。转化效率在基因型间有显著差异,从0%到69.35%。PCR确证是转基因。 最后,我们成功建立了快速和高效率的根癌农杆菌转化甘薯的新体系。该方法的策略是用甘薯的带叶片的叶柄为外植体,基于转化的分化细胞(de novo)的器官发生途径再生转基因植株。用高毒性的根癌农杆菌菌株EHA105转化甘薯品种“Jewel”。该菌株内有双元载体pBIN20-D,构建了作为选择标记的nptⅡ基因和过量表达赖氨酸的dhdps-r1基因。转化后4-6周可获得转基因植株。PCR和Southern杂交表明两个基因都整合进甘薯基因组中。反转录PCR研究了nptⅡ基因的表达。所有转基因植株都存活了并移栽到温室。盆栽实验中观察到了正常的形态。 显然,这个可在4-6周获得转基因植株,基于器官发生途径的转基因体系可以适用于遗传改良甘薯。对通过胚状体途径再生困难的品种更为有用。结合转基因植株的叶片抗性组培筛选方法,使大规模获得并筛选遗传改良的甘薯成为可能。


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