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麻疯树(Jatropha curcas)花药培养及两个核糖体失活蛋白基因的表达研究

罗言云  
【摘要】: 麻疯树(Jatropha curcas L.)系大戟科麻疯树属植物,具有显著的抗癌活性,在工业用油、生物病虫害防治、新药开发等方面也有着潜在的价值,并且又是干热河谷地区荒山造林的好树种,因此具有广泛的开发利用前景。 本实验对麻疯树的花药进行培养,从不同激素和培养方式对花药愈伤组织中PPO和POD活性的影响作了初步研究。 克隆麻疯树的核糖体失活蛋白curcin2基因,构建了curcin2基因的两种原核表达载体pET-C和pQE-C,并分别在E.coli Bl21和M15诱导表达,以比较curcin2基因的这两种原核表达系统的差异。在此基础上,进一步研究了curcin2原核表达产物在转化细胞中的存在形式。 克隆麻疯树的核糖体失活蛋白curcin,定向克隆到植物双元表达载体pBI121质粒,获得植物表达载体pBI 121-curcin。通过根癌农杆菌和叶盘转化法将curcin基因导入烟草。 1.对麻疯树花药愈伤组织诱导条件进行了优化,并对芽分化、根分化进行了初步研究,同时建立细胞悬浮培养体系。结果表明,愈伤组织诱导过程中,单核中晚期最适宜诱导,低温预处理以4℃3~5d为佳,培养基以MS+NAA2.0mg/L+KT0.4mg/L+9%蔗糖较好,最高诱导率为40.24%。芽分化培养基则仅MS+KT2.0mg/L+NAA0.1mg/L+3%蔗糖能分化出芽,诱导率为11.67%。暗培养条件下,1/2MS+IAA0.1mg/L的培养基能诱导愈伤组织生根,但分化率很低,仅6.67%。 2.研究了不同激素组合和培养方式对花药愈伤组织中PPO和POD活性的影响。结果表明,固体培养过程中,PPO和POD活性都出现2次活性高峰,一次在3d,一次在21d(添加NAA的出现在24d),分别与逆境和生长旺盛期相关,悬浮培养出现1次,在12d,出现在生长旺盛期;添加2,4-D和NAA的培养基培养的愈伤组织中,PPO和POD的活性要高于添加IBA和IAA的,添加KT的,活性要高于添加6-BA的;光照造成培养方式对PPO活性的影响要大于对POD的影响;在早期PPO和POD的活性都出现高峰,随时间的推移,活性都会下降,PPO的下降趋势远高于POD。 3.两个原核表达载体的构建:用根据curcin2基因序列(GenBank登录号:AY435214)设计的扩增成熟肽编码区的特异性引物:P1∶5’-GGATCC(BamHⅠ)ATGGCTGGTTCCACTTT-3’;P2∶5’-GAGCTC(SacⅠ)ATACATTGGAAAGATGAG GA-3’,以提取的麻疯树基因组DNA为模板进行PCR扩增,回收PCR产物并连接到pMD18-T载体,获重组子pMD-18T/curcin2,转化E.coli JM109。经测序以验证目的片段序列的正确性。用BamHⅠ和SacⅠ对重组质粒pMD-18T/curcin和表达载体pET-32(c)、pQE-30进行双酶切,回收目的片段,得到带互补粘性末端的curcin2基因片段(约930 bp)和pET-32(c)、pQE-30的线性表达载体。用T4 DNA连接酶将所得的目的片断分别与线形表达质粒pET-32(c)、pQE-30在16℃下连接,以构建重组表达载体pET-C和pQE-C。并将连接产物转入感受态的E.coli JM109,经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,证明目的片段curcin2正确插入表达载体,成功构建原核表达载体pET-C和pQE-C。 4.两种重组菌的诱导表达:将含有重组子pET-C、pQE-C的E.coli JM109转化菌于37℃下扩大培养,并提取质粒。把重组质粒pET-C转入感受态的E.coliBL21,重组质粒pQE-C转入感受态的E.coli M15。经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,证明成功获得转化子PCB和PCM。用不同的诱导温度,不同的诱导.时间及不同的IPTG诱导浓度同时作用两种重组菌PCB和PCM。经SDS-PAGE和Western-blotting检测,结果表明,在任何诱导条件下,重组子PCB都没有curcin2重组蛋白产生,而PCM都能表达出curcin2的重组蛋白,但主要以包函体形式存在。在本实验设计的诱导条件下,PCM表达curcin2的优化条件为诱导温度16℃,IPTG浓度1mmol·L~(-1),诱导时间16~24h。在此基础上,进一步研究了curcin2原核表达产物在转化细胞中的存在形式。当诱导温度较低,诱导时间延长时有可溶性的curcin2产生。 5.利用PCR技术从麻疯树基因组中分离到编码麻疯树毒蛋白(curcin)的开放阅读框(ORF)。结果表明,curcin基因无内含子存在。该序列定向克隆到植物双元表达载体pBI 121质粒,获得植物表达载体pBI 121-curcin。通过根癌农杆菌和叶盘转化法将curcin基因导入烟草。在含卡那霉素的MS_2(MS+6-BA0.1 mg/L+Kan 100 mg/L)培养基上诱导丛生芽,诱导率40%左右。丛生芽在形态上有90%是正常的。正常丛生芽在MS_3(MS+Kan 100 mg/L)培养基上诱导生根,生根率达到90%左右。最后将再生苗移栽到土壤中培养,成活率达95%。再生苗经过PCR检测证明15株中有13株整合了curcin基因。经过RT-PCR检测,有10株在转录水平上得到表达。转基因烟草对力枯丝核菌(Rhizoctonia solani)有一定程度的抗性。


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