麻疯树（Jatropha curcas）花药培养及两个核糖体失活蛋白基因的表达研究

【摘要】： 麻疯树(Jatropha curcas L．)系大戟科麻疯树属植物，具有显著的抗癌活性，在工业用油、生物病虫害防治、新药开发等方面也有着潜在的价值，并且又是干热河谷地区荒山造林的好树种，因此具有广泛的开发利用前景。 本实验对麻疯树的花药进行培养，从不同激素和培养方式对花药愈伤组织中PPO和POD活性的影响作了初步研究。 克隆麻疯树的核糖体失活蛋白curcin2基因，构建了curcin2基因的两种原核表达载体pET-C和pQE-C，并分别在E．coli Bl21和M15诱导表达，以比较curcin2基因的这两种原核表达系统的差异。在此基础上，进一步研究了curcin2原核表达产物在转化细胞中的存在形式。 克隆麻疯树的核糖体失活蛋白curcin，定向克隆到植物双元表达载体pBI121质粒，获得植物表达载体pBI 121-curcin。通过根癌农杆菌和叶盘转化法将curcin基因导入烟草。 1．对麻疯树花药愈伤组织诱导条件进行了优化，并对芽分化、根分化进行了初步研究，同时建立细胞悬浮培养体系。结果表明，愈伤组织诱导过程中，单核中晚期最适宜诱导，低温预处理以4℃3～5d为佳，培养基以MS+NAA2.0mg／L+KT0.4mg／L+9％蔗糖较好，最高诱导率为40.24％。芽分化培养基则仅MS+KT2.0mg／L+NAA0.1mg／L+3％蔗糖能分化出芽，诱导率为11.67％。暗培养条件下，1／2MS+IAA0.1mg／L的培养基能诱导愈伤组织生根，但分化率很低，仅6.67％。 2．研究了不同激素组合和培养方式对花药愈伤组织中PPO和POD活性的影响。结果表明，固体培养过程中，PPO和POD活性都出现2次活性高峰，一次在3d，一次在21d(添加NAA的出现在24d)，分别与逆境和生长旺盛期相关，悬浮培养出现1次，在12d，出现在生长旺盛期；添加2，4-D和NAA的培养基培养的愈伤组织中，PPO和POD的活性要高于添加IBA和IAA的，添加KT的，活性要高于添加6-BA的；光照造成培养方式对PPO活性的影响要大于对POD的影响；在早期PPO和POD的活性都出现高峰，随时间的推移，活性都会下降，PPO的下降趋势远高于POD。 3．两个原核表达载体的构建：用根据curcin2基因序列(GenBank登录号：AY435214)设计的扩增成熟肽编码区的特异性引物：P1∶5’-GGATCC(BamHⅠ)ATGGCTGGTTCCACTTT-3’；P2∶5’-GAGCTC(SacⅠ)ATACATTGGAAAGATGAG GA-3’，以提取的麻疯树基因组DNA为模板进行PCR扩增，回收PCR产物并连接到pMD18-T载体，获重组子pMD-18T／curcin2，转化E．coli JM109。经测序以验证目的片段序列的正确性。用BamHⅠ和SacⅠ对重组质粒pMD-18T／curcin和表达载体pET-32(c)、pQE-30进行双酶切，回收目的片段，得到带互补粘性末端的curcin2基因片段(约930 bp)和pET-32(c)、pQE-30的线性表达载体。用T4 DNA连接酶将所得的目的片断分别与线形表达质粒pET-32(c)、pQE-30在16℃下连接，以构建重组表达载体pET-C和pQE-C。并将连接产物转入感受态的E．coli JM109，经菌落PCR、双酶切及测序鉴定，证明目的片段curcin2正确插入表达载体，成功构建原核表达载体pET-C和pQE-C。 4．两种重组菌的诱导表达：将含有重组子pET-C、pQE-C的E．coli JM109转化菌于37℃下扩大培养，并提取质粒。把重组质粒pET-C转入感受态的E．coliBL21，重组质粒pQE-C转入感受态的E．coli M15。经菌落PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功获得转化子PCB和PCM。用不同的诱导温度，不同的诱导．时间及不同的IPTG诱导浓度同时作用两种重组菌PCB和PCM。经SDS-PAGE和Western-blotting检测，结果表明，在任何诱导条件下，重组子PCB都没有curcin2重组蛋白产生，而PCM都能表达出curcin2的重组蛋白，但主要以包函体形式存在。在本实验设计的诱导条件下，PCM表达curcin2的优化条件为诱导温度16℃，IPTG浓度1mmol·L~(-1)，诱导时间16～24h。在此基础上，进一步研究了curcin2原核表达产物在转化细胞中的存在形式。当诱导温度较低，诱导时间延长时有可溶性的curcin2产生。 5．利用PCR技术从麻疯树基因组中分离到编码麻疯树毒蛋白(curcin)的开放阅读框(ORF)。结果表明，curcin基因无内含子存在。该序列定向克隆到植物双元表达载体pBI 121质粒，获得植物表达载体pBI 121-curcin。通过根癌农杆菌和叶盘转化法将curcin基因导入烟草。在含卡那霉素的MS_2(MS+6-BA0.1 mg／L+Kan 100 mg／L)培养基上诱导丛生芽，诱导率40％左右。丛生芽在形态上有90％是正常的。正常丛生芽在MS_3(MS+Kan 100 mg／L)培养基上诱导生根，生根率达到90％左右。最后将再生苗移栽到土壤中培养，成活率达95％。再生苗经过PCR检测证明15株中有13株整合了curcin基因。经过RT-PCR检测，有10株在转录水平上得到表达。转基因烟草对力枯丝核菌(Rhizoctonia solani)有一定程度的抗性。