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拟南芥中与谷氨酰tRNA合成酶相互作用蛋白的筛选及相关转基因植物抗逆性研究

祝欣  
【摘要】: 植物激素脱落酸(ABA)广泛的分布于某些真菌和植物的各器官内。在植物的生长发育过程中起着重要作用,可参与调控特定基因的转录、翻译水平从而调节种子的休眠和萌发。随着深入研究发现在逆境下植物的根部和叶片部位有ABA的积累,并且ABA可以通过对离子通道开/关及对渗透压的调节从而引起气孔的开/关,从而与植物抗逆性密切相关。以野生型ABI2作诱饵蛋白使用酵母双杂交系统筛选拟南芥的cDNA文库时发现谷氨酰tRNA合成酶与其有相互作用,因而推测谷氨酰tRNA合成酶可能参与植物的抗逆行为。 在生物体内,氨酰tRNA的主要作用是在蛋白质合成过程中保证氨基酸和氨酰tRNA准确配对,从而保证蛋白质合成的正确性,其催化特异性对遗传信息的准确传递十分重要,然而不同氨酰tRNA合成酶在植物体内还承载了其它的重要职能,维持机体的正常生命活动。本论文的部分实验即通过研究对谷氨酰tRNA合成酶过量表达和抑制表达的六个转基因株系在不同的生长胁迫条件下种子萌发率和根生长情况,验证和进一步探究谷氨酰tRNA合成酶参与植物抗逆途径,及其对植物生理性状的影响。 本论文中部分实验还利用酵母双杂交系统,以氨酰tRNA合成酶为诱饵,筛选相互作用蛋白,从而完善ABA的信号传导系统。实验根据Clontech提供的方法,利用PEG/LiAc法转化酵母细胞。以22℃,光照16h/d生长2—3周的拟南芥RLD型幼苗为材料抽提总RNA,反转录第一链cDNA,构建筛选目的基因的cDNA文库。将编码诱饵蛋白的基因片段连接到可以编码融合蛋白的BD载体(即pGBKT7)构建诱饵质粒。将BD重组子,cDNA文库和AD载体质粒共转化进入酵母感受态细胞内,涂布于不含色氨酸、亮氨酸和组氨酸的三缺SD选择性平板培养基(SD/-Leu/-Trp/-His)上培养4—10d直至生长出候选的阳性克隆。将这些候选阳性克隆分别在SD两缺培养基(SD/-Leu/-Trp)和SD三缺培养基(SD/-Leu/-Trp/-His)上画线培养以确定其His报告基因的表达。将生长在SD两缺培养基上的菌落画线于干燥滤纸上,利用β-半乳糖苷酶(β-LacZ)显色反应检测菌落中LacZ报告基因的表达,以剔除部分假阳性克隆。提取经检测后仍显示阳性的酵母克隆菌落的总DNA,得到相互作用的BD和AD质粒,并将其转化大肠杆菌,以便分离得到AD重组子,使用特异的AD载体质粒的引物进行PCR检测进一步验证阳性克隆。从大肠杆菌AD转化子的阳性克隆中,提取AD重组质粒,使用两种非限制性内切酶对其进行处理,根据酶切图谱分组,去除重复的相互作用蛋白。再将从分组筛选后的这些候选阳性克隆中得到的重组质粒再与pGBKT7一起转化到AH109酵母菌中,检测转化子的His和LacZ报告基因的表达情况进行试验结果的最终验证。


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