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麦冬凝集素的分离纯化及其部分性质研究

戴蕾  
【摘要】: 本章对麦冬凝集素的研究主要包括分离纯化、性质、活性以及结构几个方面。麦冬(Ophiopogon Japonicus (Thund) Ker-Galw)块根经匀浆、生理盐水浸取、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析及Sephacryl S-100分子筛层析可纯化得到麦冬凝集素(Ophiopogon Japonicus Lectin,OJL)纯品,经SDS-PAGE检测为单一蛋白带。Sephacryl S-100分子筛凝胶过滤测得OJL的表观分子量为24KD,SDS-PAGE显示其亚基分子量约为12.0 KD,证明OJL分子为由两个亚基组成的同源二聚体。OJL可以凝集素兔血细胞,其活性的最低浓度是15.6μg/ml。在对OJL性质研究时发现,随着温度的升高,其凝血活性不断减弱。并且在90℃处理20min后,OJL由于变性而完全失去了凝集活性,说明OJL是一种对热比较敏感的凝集素。OJL在一定的pH范围内酸碱性对OJL凝血活性基本没有什么影响,其最适pH为4-8,极端pH才使OJL凝血活性略微降低,表明OJL对pH具有一定的耐受性。经极端pH处理后OJL的荧光光谱与天然OJL的荧光光谱相似表明OJL活性丧失并没有引起构象的变化。OJL在经EDTA透析后,活性保持不变,而且金属离子的加入并不改变其活性,证明其凝血活性不依赖于金属离子;OJL对兔血细胞的凝集作用能够完全被甘露聚糖抑制,表明OJL是一种典型的甘露糖结合凝集素。 变性剂对OJL的变性研究表明3mol/L的盐酸胍能使OJL完全失去凝集活性,其荧光强度随着盐酸胍的浓度的增大而增强,并发生了红移。由此说明,高浓度的盐酸胍作为变性剂破坏了蛋白质分子的有序结构,使其疏水氨基酸Trp残基周围的疏水环境遭到破坏,Trp分子从蛋白质疏水内部暴露出来。而8mol/L脲仅使OJL丧失约33%的凝血活性。说明和盐酸胍相比脲对OJL的变性作用并不明显。SDS对OJL的变性作用研究表明随着SDS浓度的增加,OJL的凝血活性逐渐略有下降,在SDS浓度达到20mmol/L时,则由于发生明显的溶血现象,而完全检测不到OJL的凝血活性。 NBS滴定法修饰OJL,在自然条件下,有1个Trp残基被修饰,Trp残基的修饰并没有引起OJL活性的明显改变,但是其荧光强度随着NBS浓度的增高而下降。2,3-丁二酮对OJL精氨酸残基的化学修饰表明修饰后的OJL血凝集活性几乎完全丧失,且其荧光强度明显下降。说明Arg是维持其活性的必需基团,可能位于OJL的血凝活性中心或位于中心附近参与了活性中心构象的维持,Arg被修饰后OJL活性的丧失很可能是由于活性中心的破坏或活性中心构象的改变所造成的。而其他氨基酸的化学修饰研究表明Tyr,Ser/Thr等残基与OJL凝集活性无关,氨基酸的修饰并没有引起活性的改变。 天然OJL的内源荧光光谱研究表明:激发光波长为280nm时,其最大荧光发射峰位在328nm处,荧光光谱未见有酪氨酸(Tyr)残基的发射峰,表明OJL分子中很可能发生了从Tyr到Trp的能量转移;激发波长为295nm时,其最大荧光发射峰位也在328nm处,比游离Trp的最大荧光发射峰(348nm)蓝移了近20nm,说明Trp周围的极性较弱,处于疏水的微环境。 不同淬灭剂对OJL的荧光淬灭研究表明丙烯酰胺作为不带电荷的中性淬灭剂能很好的淬灭荧光基团的荧光,而且几乎是完全淬灭(93.46%)。而对于带电荷的淬灭剂CsCl和KI对OJL的荧光淬灭程度较小(分别为41.25%和55.56%)。淬灭研究的结果表明凝集素OJL的荧光基团Trp和Tyr主要位于凝集素分子的疏水内核中。 抑菌实验结果表明OJL对水稻稻瘟病菌和玉米弯孢菌的生长表现出抑制作用,其最低的抑制浓度均为0.5mg/ml。这是第一次在百合科植物中发现的具有抑制真菌的甘露糖结合凝集素。


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