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聚乙二醇化尿酸酶的制备、纯化及性质研究

张锐  
【摘要】: 尿酸酶分解嘌呤代谢最终产物尿酸,生成水溶性更强,更易分解的尿囊素。当尿酸在血液中沉积,引起肾衰竭以及痛风等疾病。尿酸酶针对禁忌常规治疗和常规疗法无效的患者,能快速降低血液中尿酸盐的含量。但作为外源蛋白有较高抗原性,影响了尿酸酶的活性。需要在尿酸酶分子表面结合一种水溶性高聚物,从而降低尿酸酶的抗原性,延长它在体内的半衰期。 蛋白质PEG修饰技术在过去的20年中得到了快速发展,已有多篇文献报道了经PEG修饰的蛋白质药物降低了免疫原性、提高了稳定性、延长了半衰期,并用于临床治疗各种疾病。本文研究尿酸酶聚乙二醇修饰的条件、纯化方法以及修饰产物生物学活性和酶动力学性质的改变。 通过对温度、pH、尿酸酶浓度、PEG和尿酸酶质量比等条件的筛选,确定pH8.5,4℃,尿酸酶与PEG_2-NHS质量比1:10,尿酸酶浓度2mg/mL为最佳修饰条件,10min内反应完全。 凝胶过滤层析测定尿酸酶分子量为70kD,结合还原和非还原性SDS-PAGE判断尿酸酶由两条分子量30kD的亚基通过二硫键组合而成。制备型PAGE电泳分离纯化后,尿酸酶和PEG-尿酸酶通过SDS-PAGE电泳检测均为单一条带。收集凝胶,回收反应混合液总活性的46.7%,目标产物130kD的PEG-尿酸酶占12%。 尿酸酶最适温度和pH分别为40℃、pH8.5,经PEG修饰后,最适温度和pH变为35℃、pH8.0。修饰前后的尿酸酶在pH7.5-9.0范围内,温度40℃以下都比较稳定,PEG-尿酸酶在各个pH范围内都比尿酸酶相对稳定,修饰后尿酸酶的热稳定性也有所提高。在最适条件下,测定尿酸酶和PEG-尿酸酶Km分别为16.62×10~(-5)mol/L、17.8×10~(-5)mol/L。测定了尿酸酶和PEG-尿酸酶Km随pH、温度改变的变化情况,Km均高于最适条件得出的结果。 采用TNBS法测定尿酸酶的氨基修饰率为16.7%。修饰后的PEG-尿酸酶抗胰蛋白酶水解能力明显高于未修饰的尿酸酶,在胰蛋白酶作用40min后仍保留原活性的20%,而尿酸酶在胰蛋白酶作用30min后活性就完全丧失。


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