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不同光照强度处理对烟草花叶病毒感染烟草叶片光合基因表达的影响

张爽  
【摘要】: 烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是世界性分布的病毒,能侵染约300种植物并造成严重危害。病毒侵染通常会引起植物重要生理功能的改变,其中对光合作用的影响是最关键的因素。目前,烟草花叶病毒对植物光合作用影响等方面的研究已经越来越广泛,然而从分子生物学角度研究病毒对光合作用相关基因影响的却相对较少。本文以正常健康的烟草叶片以及病毒感染的烟草叶片为材料,成功建立了烟草叶片总RNA的提取方法,并且仔细分析了TMV感染对烟草叶片中和光合作用密切相关的几个基因表达的影响,现简要总结如下: 首先,为了从含有较多多糖、多酚等次生代谢产物的病毒感染烟草叶片中提取高质量的RNA,我们通过改进本实验室传统方法建立了适合病毒感染烟草叶片总RNA提取的新方法:在提取缓冲液中加入不可溶的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)和高浓度的β-巯基乙醇,并且在提取过程中加长和变性试剂反应的时间。从RNA的质量、提取效率、提取时间以及试剂费用等多方面比较了普通试剂盒提取法,实验室传统法以及改进后的方法,结果表明:改进后的提取方法为病毒感染烟草叶片总RNA的最佳提取方法,所提取RNA完整,纯度较高(OD_(260)/OD_(280)比值在1.8~2.0之间,OD_(260)/OD_(230)的比值大于2.0),产率可达到80μg·g~(-1)·FW~(-1)以上。通过紫外吸收光谱(200~300 nm)扫描,在260nm处呈现单一的峰,也表明RNA纯度较高。同时,细胞核基因Lhcb1及叶绿体基因rbcL的cDNA都通过RT-PCR成功扩增出来。实验中还发现编码PR-1a蛋白的pr-1a基因在病毒感染的烟草叶片中有表达而在正常对照烟草叶片中没有表达。实验结果表明,此方法所得RNA质量足以满足基因表达和分子克隆等分子生物学研究需要。 其次,为了研究光强和TMV感染对烟草光合作用相关基因表达的影响,我们检测了和光合作用密切相关的部分基因在转录水平上的表达含量。通过提取叶片总RNA,反转录,设计相关基因的引物来扩增基因,在不同光强下基因表达的半定量分析来了解光合作用相关基因的表达特异性及表达程度,研究了PSⅡ中的psbA基因,Lhcb1基因,以及编码Rubisco蛋白大亚基和小亚基的rbcL基因和rbcS基因。通过研究发现不同光强下psbA基因在烟草叶片中均有较高的表达量,正常叶片中psbA在高光强和低光强下表达量还有所增加,在病毒浸染的叶片中psbA在低光强下表达量增加,而在高光强下相对于中光强没有明显变化。而Lhcb1基因在转录水平上的表达受光照的控制,且明显地表现出对光照时间的依赖型,光照1h时表达量很小,随着光照时间的增加表达量有所增加。还发现rbcL基因和rbcS基因在病毒浸染的叶片中表达含量减少,rbcS基因受到的影响相对较小。


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