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不同灵芝的遗传特异性和药效差异的比较研究

郑林用  
【摘要】: 灵芝是灵芝属(Ganoderma)的总称,隶属于真菌界(Kingdom Fungi),担子菌门(Basidiomycota),担子菌纲(Basidiomycetes),灵芝目(Ganodermatales),灵芝科(Ganodermataceae)。灵芝在我国已经有上千年的应用历史,现代研究表明其具有抗肿瘤、提高机体免疫功能、治疗心脑血管疾病等功效。 但由于目前进行灵芝栽种、品种选育的多为农业科学工作者,使其缺乏“传统药材”的系统研究,加之我国的食药用菌品种登记制度尚为完善,也造成我国灵芝资源品种混杂,遗传关系不清,且长期以来由于灵芝更多的被作为“高端农产品”进行加工,使灵芝也存在菌株的功效和化学成分不明的情况,均制约了其更好的应用和开发。 针对上述现象,本论文对不同灵芝的遗传特异性和药效差异进行了比较研究。对不同来源的30个灵芝菌株进行了拮抗实验,并将拮抗较强、生长势旺盛的18个灵芝菌株作为研究对象,从菌丝拮抗、菌株表型、同工酶、全基因组、rDNA五个层次揭示了18个灵芝菌株间的遗传特异性;并比较研究了18种灵芝的主要药性成分及药理作用的差异,筛选出了药效作用较好的菌株。 本论文主要开展了以下的研究工作: 1.为了获得灵芝菌株间的亲缘关系,了解菌株间的遗传差异,本研究利用拮抗分析技术,初步获得了灵芝菌株间的亲缘关系,并选定18个菌株作为本论文的研究对象。实验将不同种类及不同来源的实验菌株,活化培养后进行两两拮抗实验,统计拮抗强弱数值,综合菌株间的拮抗关系,初步判定菌株的亲缘关系。结果发现受试灵芝菌株间都存在拮抗关系,紫芝与紫灵芝菌株拮抗较弱,而美国灵芝与其他所有菌株都存在较强的拮抗关系。 2.采用短段木大棚栽培品比实验,对不同灵芝的子实体形态、产量、生长周期、产孢量、孢子外部形态等表型遗传性状进行了比较研究。确定紫芝与紫灵芝、美国大灵芝、其余灵芝间的亲缘关系均分别较近,遗传差异性小;且京大、美国大灵芝、赤芝适宜作为大规模生产品种推广使用。 3.实验通过灵芝菌丝体样品的制备、电泳、染色和数据处理等步骤,对18个灵芝进行酯酶同工酶研究,将酯酶同工酶图谱转化为0,1数据矩阵,采用UPGMA计算方法聚类,得到亲缘关系图谱。实验结果发现:18个灵芝菌株具有0.45的遗传相似系数,其中紫芝与紫灵芝菌株遗传相似系数为0.88,亲缘关系较近;美国大灵芝和赤芝菌株与其它菌株亲缘关系相对较远,只有0.45的遗传相似度。 4.采用CTAB法提取基因组DNA,利用EcoRⅠ、MseⅠ进行双酶切后,加入接头,通过预扩增及选择性扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳,显色;采用UPGMA计算方法进行聚类分析。实验用14对E3/M3引物对18个菌株进行AFLP扩增,统计得到177条清洗易辨的多态性条带;18个灵芝菌株遗传相似系数为0.21,聚为3个类,分别为赤芝类、紫芝类和美国灵芝类。其中紫灵芝与紫芝菌株聚为一类,具有0.81的遗传相似系数,亲缘关系较近。美国灵芝与包括京大灵芝在内的其他灵芝菌株亲缘关系较远。 5.利用ITS PCR-RFLP技术,考察灵芝菌株ITS序列差异,分析灵芝菌株间的系统发育关系,研究灵芝菌株间的亲缘关系。试验将灵芝ITS基因序列扩增后,采用HinfⅠ,HaeⅢ,TaqⅠ,MspⅠ四个内切酶进行酶切,将各个酶切产物在琼脂糖凝胶进行电泳检测,数据统计后UPGMA法聚类分析。分析结果为18个灵芝菌株在ITS PCR-RFLP水平上分为3个类,美国灵芝单独为一类,与其他灵芝菌株亲缘关系较远。紫芝与紫灵芝菌株完全聚在一起,亲缘关系很近;其余15个菌株间亲缘关系较近。 从1~5的遗传性状差异研究表明:18个灵芝菌株的遗传多样性较高,遗传背景丰富;在表型遗传性状上表现出一定的遗传差异;18个菌株在酯酶同工酶、AFLP及ITS PCR-RFLP三个水平上分别具有0.45、0.21、0.59的遗传相似系数。从细胞、表型遗传特性、酶、全基因组、核糖体基因组指纹图谱五个层次上的综合研究表明美国大灵芝与其它菌株间亲缘关系较远,紫芝和紫灵芝亲缘关系较近、其余15个灵芝菌株间亲缘关系较近。 6.以灵芝多糖和三萜类化合物含量及三萜成分组成作为评价指标,确定不同灵芝菌株间药效成分的差异。研究表明:菌株差异直接影响灵芝多糖、三萜含量和成分,18个灵芝菌株子实体多糖含量以紫灵芝子实体多糖含量最高,其次为灵芝,以后依次为日本平芝、美国大灵芝、德昌灵芝1~#等;京大灵芝子实体多糖含量最低。18个灵芝菌株子实体的三萜含量以京大灵芝含量最高,紫灵芝子实体三萜含量最低。比较18个灵芝菌株子实体的多糖和三萜总含量发现:京大灵芝主要药用成分总含量最高,其次为日本平芝,紫灵芝主要药用成分总含量最低。但是同一灵芝多糖和三萜成分的含量之间没有必然关系,同一灵芝菌丝体与子实体间其多糖和三萜的含量也有明显区别。 7.研究不同灵芝菌株对小鼠免疫功能的影响。通过比色法测定鸡红细胞免疫后小鼠血清溶血素抗体水平,研究不同灵芝菌株对小鼠体液免疫的影响;通过碳粒廓清试验,测定不同灵芝菌株对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响;通过小鼠脾淋巴细胞转化实验,观察不同灵芝菌株对小鼠特异性细胞免疫的功能影响。研究表明:紫灵芝,紫芝,日本平芝,红芝样品子实体9g/kg剂量可对抗环磷酰胺致小鼠体液免疫抑制,提高血清溶血素抗体水平。紫灵芝、京大、美国大灵芝、甜芝、紫芝样品子实体9g/kg剂量对氢化可的松致小鼠细胞免疫抑制有对抗作用,能使免疫功能低下小鼠吞噬指数和吞噬系数得到恢复;紫灵芝、日本平芝、紫芝样品子实体9g/kg可显著对抗氢化可的松致小鼠T淋巴细胞免疫抑制,提高脾淋巴细胞增转化率。结论:紫灵芝,紫芝对小鼠免疫功能有良好的调节作用。不同的灵芝菌株间,其药效存在一定的差异。 8.研究不同灵芝菌株对小鼠负重游泳时间的影响。将小鼠随机分组,给药15天后通过在小鼠尾部负重相当与自身体重8%的重物,记录各组小鼠的游泳时间,来比较灵芝对机体抗疲劳作用的功效大小。结果显示,与模型组比较,各灵芝菌株均可延长小鼠的游泳时间,但效果有差异,其中紫灵芝,明星1~#,日本赤芝,信州灵芝,京大,美国大灵芝,赤芝,甜芝,紫芝,灵芝,德昌灵芝4~#,红芝,德昌灵芝1~#样品与模型组比较,效果显著。 9.比较了不同灵芝菌株对小鼠睡眠状况的影响。将小鼠随机分组,灌胃3天后,小鼠腹腔注射戊巴比妥钠生理盐水溶液(45 mg/kg),以小鼠反正反射消失为入睡时间,记录小鼠的进针、入睡及苏醒时间,比较小鼠入睡的潜伏期及睡眠期时间。结果表明,与模型组比较,紫灵芝、日本赤芝、京大、美国大灵芝、甜芝、紫芝样品子实体水煎液有显著减少戊巴比妥钠诱导小鼠入睡的潜伏期,延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的作用,其他样品组有趋势,而无显著性差异。 10.研究不同灵芝菌株对小鼠断头后喘气时间的影响。将小鼠随机分组,15天后小鼠逐只断头,记录小鼠断头后张口喘息停止时间,以此作为耐缺氧指标,观察灵芝菌株对小鼠脑缺氧的保护作用。结果显示,与模型组比较,信州灵芝、赤芝子实体水煎液可显著延长小鼠断头后的张口喘气时间,其他灵芝组与模型组比较有所趋势,而无显著性差异。 11.研究不同灵芝菌株对PC12细胞增殖及分化的影响。观察不同灵芝子实体水煎液对PC12细胞的增殖作用,研究表明:与对照组比较,紫灵芝、京大灵芝、美国大灵芝、日本赤芝、京大、日本平芝、灵芝、灵芝10~#、红芝和德昌1~#对PC12细胞具有明显的增殖作用。观察不同灵芝子实体水煎液对PC12细胞分化的影响,研究表明:与空白对照组比较,受试灵芝菌株均可促进PC12细胞的分化,但分化率和分化程度有所不同,其中紫芝、灵芝、园艺6~#、红芝和德昌灵芝1~#对PC12细胞分化的影响最为明显。综合评价表明:灵芝和德昌灵芝1~#对PC12细胞具有较好的促进再生的作用。 从7~11的药效差异研究表明:不同灵芝菌株在同一药效作用上存在差异性,且在不同的药理实验中同一灵芝菌株发挥的药效作用大小也不相同。在增强机体免疫系统作用方面,紫灵芝和紫芝对机体的免疫调节作用较其它16个菌株好。在缓解机体疲劳的作用方面,受试的菌株大部分表现较好的作用,包括日本赤芝,信州灵芝,京大,美国大灵芝,赤芝,甜芝,紫芝,灵芝,德昌灵芝4#,红芝,德昌灵芝1~#。在改善机体睡眠状况方面,紫灵芝、日本赤芝、京大、美国大灵芝、甜芝、紫芝有较好的作用。在增强机体耐缺氧能力方面,信州灵芝和赤芝功效较好。在对PC12细胞保护方面,灵芝和德昌1~#效果最好。


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