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损伤的前交叉韧带和内侧副韧带中的赖氨酰氧化酶和基质金属蛋白酶的研究

谢静  
【摘要】:前交叉韧带(Anterior cruciate ligament,ACL)和内侧副韧带(Medial collateralligament, MCL)是两个极容易受损伤的膝关节组织。损伤的内侧副韧带具有较强的自我修复能力,即使在韧带中部完全撕裂的情况下,在一个月的时间内也能恢复并保留原有韧带的功能。而损伤的前交叉韧带自我恢复能力极弱,精心的外科手术治疗也不能恢复其功能。前交叉韧带的损伤会引起膝关节的不稳定、膝关节疼痛,甚至还会导致膝关节内其他组织的进一步降解和骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)的发生。 韧带损伤后的修复过程,都会伴随损伤的细胞外基质的降解和新的细胞外基质的合成。基质金属蛋白酶家族(Matrix Metalloproteinases, MMPs)在这个降解与合成的动态平衡中起着重要的作用。与此同时,越来越多的证据表明赖氨酰氧化酶家族(Lysyl Oxidase Family, LOXs)与组织的损伤、修复有直接的联系。赖氨酰氧化酶催化胶原蛋白和弹性蛋白的赖氨酸肽残基使其变成乙醛肽,从而引起这些不稳定的乙醛肽之间的相互交叉连接,形成不溶的细胞外基质蛋白网。赖氨酰氧化酶的这种能力,使它担当起了细胞外基质生成、稳定和修复的职能。赖氨酰氧化酶家族的每个成员(LOX和LOXL-1,2,3,4)的这种促进胶原之间相互连接的缩合反应功能,到目前为止已经陆续得到证实。但是,赖氨酰氧化酶家族在前交叉韧带和内侧副韧带中的表达情况的研究还不为人们所知。 韧带损伤后会出现炎症反应时期(Inflammatory phase)。炎症反应时期伴随各种细胞因子(诸如炎症因子TNF-α、IL-1β和生长因子TGF-β_1等)的产生,这些细胞因子作为炎症反应调节者参与韧带的修复。论文通过体外细胞实验,研究赖氨酰氧化酶家族和基质金属蛋白酶家族的表达。本文的主要研究内容和研究结果如下: 首先,用力学拉伸模拟体内韧带细胞的损伤,检测损伤后LOX家族的表达。实验用等双轴拉伸装置,对ACL和MCL细胞同时施加不同程度的力学刺激(6%生理拉伸组;12%损伤拉伸组),结果显示,力学刺激上调LOX家族的表达,且12%的力学损伤使LOX家族的表达远高于6%的生理拉伸。6%生理拉伸时,LOX家族成员在ACL和MCL细胞中都呈上调趋势,但LOX和LOXL-4在ACL中的表达高于MCL,LOXL-3在MCL中的表达高于ACL,而LOXL-1和LOXL-2则有一定的波动性。12%力学损伤时,LOX家族在MCL细胞中的高表达均明显高于在ACL中的表达。 其次,在外源性转化生长因子TGF-β_1、肿瘤坏死因子TNF-α、白介素-1beta(IL-1β)作用下,考察正常ACL和MCL细胞中LOX家族的差异性表达。结果显示,TGF-β_1和IL-1β均上调LOX家族的表达,且LOX家族在MCL细胞中的表达总体上高于在ACL中的表达。TGF-β_1引起LOX家族在两种分细胞中的高表达是一个持续的过程;而IL-1β上调LOX家族则呈剂量依赖性。TNF-α抑制LOX家族在两种细胞中的表达,且在ACL细胞中的抑制效果比MCL明显。 再次,在损伤的ACL和MCL细胞中(即12%力学拉伸实现细胞损伤),考察TGF-β_1、TNF-α、和IL-1β作用下LOX家族的差异性表达。结果发现,TGF-β_1和IL-1β均增强了LOX家族在损伤的ACL和MCL中的表达,且TGF-β_1的作用效果强于IL-1β。TGF-β_1引起损伤的ACL和MCL细胞中LOXL-1,3和4的高表达强于TGF-β_1对正常细胞的刺激,而LOX和LOXL-2弱于TGF-β_1对正常细胞的刺激。IL-1β上调正常ACL细胞中LOX家族的表达高于损伤的ACL细胞,而损伤的MCL中IL-1β上调LOX家族远高于正常的MCL。TNF-α促使损伤的ACL和MCL中LOX家族(LOXL-2除外)出现峰值后迅速下降,作用24小时后基本低于正常对照组。LOXL-2在损伤的细胞中受TNF-α刺激后一直呈下降趋势,但弱于TNF-α对正常细胞的下调。 接着,在实验室已有研究的基础上,在损伤的ACL和MCL细胞中,考察MMP家族部分成员受TGF-β_1、TNF-α、IL-1β作用后的差异性表达。结果显示,三种因子都高表达MMP-1,2,3和12,且MMPs在ACL中的表达均高于在MCL中的表达。炎症因子TNF-α和IL-1β上调了MMPs的基因表达,且TNF-α引起的上调比IL-1β高;而酶谱检测MMP-2蛋白时,发现IL-1β引起的MMP-2活性带的表达比TNF-α强。生长因子TGF-β_1同样引起MMP-1,2,3和12在损伤的ACL和MCL中的高表达,且ACL中的表达均比MCL中高。 接着,为了进一步模拟体内环境,实验用滑膜细胞和前交叉韧带细胞实现共培养,考察共培养条件下,损伤的前交叉韧带中MMP-2的蛋白表达。结果显示,共培养促进MMP-2在ACL细胞中的表达,但共培养引起的MMP-2高表达低于单损伤条件引起的MMP-2高表达,而共培养下损伤的ACL中MMP-2的高表达强于共培养下正常ACL的表达或单培养下损伤ACL中的表达。 最后,实验采用MMP抑制剂作用于共培养下损伤的前交叉韧带细胞(或损伤的滑膜细胞),结果发现,6种抑制剂均不同程度下调MMP-2在损伤的前交叉韧带细胞或滑膜细胞中的表达,其中以通路NF-kappa B的抑制剂Bay11-7082和AP-1的抑制剂Curcumin效果最为明显,MMP-2的活化形式被抑制,仅存在少量MMP-2的酶原形式的表达。 综合以上研究结果,我们证实,与MCL相比,生长因子TGF-β_1和炎症因子TNF-α、IL-1β均引起正常/损伤的ACL细胞表达相对较低的LOX家族,使损伤后的细胞外基质朝着不利于修复的方面发展,我们推断这可能是ACL不能自我修复的原因之一;同时三种因子均引起损伤的ACL中MMPs的高表达远超过损伤的MCL,过高表达的MMPs使损伤后的细胞外基质朝着有利于降解的方面发展,我们推断这可能是ACL不能自我修复的另一个原因。 研究LOX家族在损伤ACL和MCL中的表达,可以为临床上韧带创伤的治疗提供定量的参考依据。增强LOX家族在损伤的韧带细胞中的作用,也可能为ACL的修复提供一种方法;同时共培养实现更深层次体内环境的模拟,在共培养下,多种抑制剂均能下调损伤的ACL中MMPs的表达,这可能为ACL治疗提供一种思路。


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