烟草NtLEA1基因的克隆与功能研究

【摘要】：胚乳后期丰富蛋白（late embryogenesis abundant proteins，LEA蛋白）是一类在种子胚胎发育晚期丰富聚集的蛋白质。LEA蛋白是一类多家族蛋白，并在生物界广泛分布。LEA基因除在正常种子发育后期丰富表达外，高盐、干旱和冷害等环境因素及脱落酸（ABA）等植物激素也可诱导一些LEA基因在叶片、根等植物营养器官中表达。研究表明，LEA蛋白与植物抗逆密切相关，LEA基因的过表达能提高受体植株的耐盐、耐干旱能力。烟草作为一种重要的模式植物，普遍用于研究其他植物的LEA基因的功能，但其自身的LEA基因的相关研究尚未见报道。随着烟草基因组测序工作的完成，挖掘信息，研究烟草LEA基因，探索其功能，对植物抗逆基础研究领域具有重要意义，并有望通过遗传育种手段提高烟草的抗旱耐盐性。本研究结合生物信息学方法和分子克隆手段从烟草中克隆到一个LEA基因，命名为NtLEA1，并通过生物信息学分析、逆境胁迫的表达分析和转基因烟草植株表型分析，来初步探索NtLEA1基因的功能，主要工作内容及成果如下： ①结合生物信息学分析方法，用番茄的LEA基因序列同源检索烟草EST数据库，EST序列拼接得到预测的烟草LEA基因，通过分子克隆获得目的基因的ORF编码区序列，总长度为501bp，GC含量为51.5%，与番茄LEA基因序列相似度达78%，命名为NtLEA1基因。该基因编码166个氨基酸残基，预测的蛋白质分子量为17.3551kD，等电点为8.62，不稳定系数为15.71，亲水性总平均值为-1.103。保守结构域预测NtLEA1蛋白含有7个串联重复的11-氨基酸保守基序，属于第三组LEA蛋白。生物信息学分析表明NtLEA1蛋白二级结构以α螺旋结构为主，具有高亲水性和热稳定性。启动子序列分析表明NtLEA1基因上游序列中含1个胚乳表达元件（Skn-1motif）、2个ABA应答元件（ABRE）、1个MeJA响应元件（CGTCA-motif）、1个水杨酸响应元件（TCA-element）、1个高温胁迫应答元件（HSE）、1个干旱应答元件（MBS）及2个光调控元件（Box4）。 ②半定量PCR分析表明NtLEA1基因的表达受PEG模拟干旱胁迫、ABA、盐胁迫的诱导，几乎不受冷胁迫的诱导，其中受盐胁迫诱导最为强烈，由此推断NtLEA1基因与烟草抗逆相关。 ③为进一步探索NtLEA1基因的功能，本研究构建了一个由CaMV35S启动子驱动的植物双元表达载体pCXSN-NtLEA1，并由根瘤农杆菌LBA4404介导通过叶盘转化法转化烟草，经抗性筛选、35S启动子和潮霉素抗性基因hpt的PCR鉴定及相对荧光定量PCR分析确定获得了NtLEA1过表达转基因株系（OEX-L1~L4）。 ④T_0代NtLEA1过表达烟草植株抗盐性分析表明：1.5%NaCl溶液胁迫处理培养12天后，转基因株系（OEX-L1~L2）叶片仍较饱满，颜色翠绿，而对照植株（WT）叶片开始发黄萎缩；120mm/L NaCl胁迫培养20天，NtLEA1过表达株系（OEX-L2）组培苗的生根率（80%）高于野生型对照株系的生根率（60%）；1.5%NaCl溶液胁迫3d后，过表达植株（OEX-L2）和对照植株（WT）幼苗叶片的总叶绿素含量均较处理前有所下降，但转基因植株的下降率（16.3%）明显低于对照植株（28.6%），由此推断NtLEA1基因的过表达提高了转基因烟草植株的抗盐能力。