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内皮细胞条件培养液对肝癌细胞癌干细胞表型及肝癌干细胞迁移的影响

冯川  
【摘要】:癌症是威胁人类健康的最严重疾病之一。世界各国常见肿瘤的死亡率前3位依次是肺癌、胃癌和肝癌。肝癌不仅死亡率高,且近年来发病率也在不断上升,对肝癌的治疗和预防以及相关机理探索一直是肿瘤领域的研究热点。目前治疗肝癌的主要手段有外科手术切除、放射治疗、抗癌化学药物治疗、肝移植等,但这些方法还不能解决其复发和转移问题,肝癌的治疗仍然是临床科学家们面临的挑战。近年研究表明,恶性肿瘤是来源于数量微小、具有自我更新和多分化潜能的癌干细胞(Cancer stem cells,CSCs)。CSCs被认为是维系肿瘤起始和生长以及形成不同分化程度癌细胞及预后不良的根源,在癌症复发转移中起决定作用。癌干细胞学说的提出为癌症的治疗带来了新的曙光,CSCs靶向干预成为癌症治疗的全新策略。内皮细胞(Endothelial cells,ECs)是血管壁的重要组成成分,也是肿瘤微环境的重要组成成分。有研究发现内皮细胞与肿瘤细胞之间的交互对话对于促进CSCs表型、增强肿瘤复发转移可能起着重要调节作用。肝脏是富含血管的组织,在肝癌发生发展过程中,内皮细胞参与构建的肿瘤微环境是否促进肝癌细胞CSCs表型?是否影响肝癌干细胞(Liver cancer stem cells,LCSCs)的迁移行为?这些问题目前还不清楚。为此,本文主要考察了内皮细胞微环境对肝癌细胞CSCs表型以及LCSCs迁移行为的影响。主要研究内容和结果如下:①内皮细胞条件培养液(EC Conditioned Medium,EC-CM)对肝癌细胞CSCs表型的影响分别培养人脐静脉内皮细胞和人肝癌细胞MHCC97H,收集EC-CM与肝癌细胞共培养,检测EC-CM对人肝癌细胞药物敏感性、克隆形成能力、成球能力、迁移能力、侵袭能力以及癌干细胞表面标志物CD133表达的影响。结果发现,EC-CM能显著提高MHCC97H细胞对抗癌药物顺铂和五氟尿嘧啶的药物抵抗能力(p0.05),增强MHCC97H细胞的克隆形成能力(p0.01)和肿瘤球形成能力(p0.05)。Transwell实验和流式细胞术证实EC-CM不仅增强MHCC97H细胞的迁移能力和侵袭基底膜的能力(p0.05),而且上调LCSCs标志物CD133的表达(p0.01)。实验结果表明,EC-CM能够促进MHCC97H细胞的癌干细胞表型。②LCSCs的分选和鉴定采用体外肿瘤球培养法进行LCSCs的分选。将MHCC97H细胞进行无血清悬浮培养,每隔5-6天进行传代。利用第三代球体细胞进行药物敏感性、克隆形成能力的检测以及肝癌干细胞标志物CD133,CD44,Oct3/4的检测。结果发现,通过体外肿瘤球分选法获得的球体细胞与MHCC97H细胞相比具有显著的癌干细胞特征。球体细胞对不同浓度的抗癌药物顺铂和五氟尿嘧啶表现出更强的耐药性(p0.05)。球体细胞与MHCC97H细胞相比具有更强的克隆形成能力(p0.05)。流式细胞仪检测发现球体细胞与MHCC97H细胞相比癌干细胞标志物CD133,Oct3/4)的表达明显升高。这些结果表明,通过体外肿瘤球分选法富集的球体细胞是不同于MHCC97H细胞的亚群,具有CSCs特征。③EC-CM对LCSCs迁移行为的影响。采用Transwell考察了EC-CM作用下LCSCs迁移行为的变化。结果发现,EC-CM能够显著促进LCSCs的迁移能力(p0.05)。进一步通过免疫荧光染色观察了EC-CM作用下LCSCs细胞骨架F-actin的变化,结果发现,EC-CM可能通过降低LCSCs中F-actin的表达(p0.001)。原子力显微镜结果显示EC-CM作用LCSCs后细胞的杨氏模量降低。结果提示EC-CM可能通过减少F-actin的表达来降低LCSCs硬度,从而提高LCSCs的运动、变形能力,促进LCSCs的迁移。本文的研究结果表明,内皮细胞微环境能够促进MHCC97H细胞的癌干细胞表型,通过改变细胞骨架组装调节LCSCs的力学特性,促进LCSCs的迁移能力。该研究结果为以肝癌干细胞和肝癌干细胞微环境为靶点的肝癌治疗提供了理论基础和参考依据。


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