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番茄SlNAC4和SlDEAD31基因在果实成熟及非生物胁迫响应中的功能研究

朱明库  
【摘要】:NAC(NAM/ATAF1/2/C UC2)转录因子家族基因和DEAD-box解旋酶家族基因在植物生长发育,生物和非生物胁迫响应中均发挥重要功能。其中,NAC转录因子是植物特异的最大的转录因子家族之一,目前有关NAC转录因子的功能研究已取得很大进展,但主要集中于模式植物拟南芥和水稻中。另外,尽管部分成员的功能被研究确定,但NAC转录因子在分子水平上发挥功能的机制依然尚未清楚地阐明。番茄不仅是世界上广为栽培的高营养高价值的蔬菜作物,同时也是研究肉质果实发育和成熟的最佳模式植物。当前有关番茄中发育或胁迫相关的NAC基因的报道依然很少。番茄nor(non-ripening)突变体的形成正是因为NAC家族中NOR基因的突变引起的,这激发我们继续挖掘NAC基因家族中其他可能参与果实成熟调控的新成员。最近,番茄全基因组测序的完成为研究番茄中特定基因的功能提供了信息基础和方便。在本研究中,我们在茄科数据库SGN中筛选到7个番茄NAC基因,分别命名为Sl NAC4-Sl NAC10。随后,我对其基因结构、分子特征、系统进化关系以及对多种激素和非生物胁迫的响应等进行了系统分析。我们发现它们编码的氨基酸序列与已知的其他植物NAC蛋白具有很高的相似性,特别是在NAC结构域。结构分析表明,除了Sl NAC10基因外,其他六个Sl NAC基因均包含保守的内含子-外显子结构。进化树分析表明,Sl NAC4属于胁迫相关NAC转录因子,而Sl NAC5、Sl NAC7和Sl NAC10属于发育有关的NAC转录因子。定量RT-PCR分析表明,这七个Sl NAC基因均表现出不同的组织特异性表达特征(比如根、叶、花和果实),说明它们可能在番茄生长发育过程中发挥着特异的和重要的作用。除了Sl NAC6基因,其他六个Sl NAC基因的表达受到多种激素处理的不同程度诱导,包括ABA、ACC、GA3、Me JA和IAA。同时,Sl NAC4-Sl NAC10基因的表达也受到多种非生物胁迫处理的不同程度诱导,包括盐、高温、低温,脱水和伤害。这些结果为进一步探索NAC基因在番茄生长发育以及环境逆境胁迫响应中的功能提供了有价值的信息。根据基因组织表达模式的结果,我们筛选出了Sl NAC4基因,其在果实成熟时期高量表达而在青果中少量表达,暗示Sl NAC4基因可能参与了果实的成熟调控过程。果实成熟是一个高度程序化的复杂生物学过程,涉及众多因素的参与,包括内源激素和遗传调控因子以及外部环境信号等。目前虽已证实NOR基因是位于乙烯信号途径的上游位点发挥作用,但其发挥功能的的调控机制仍不清楚。为了进一步探索Sl NAC4基因在果实成熟中的功能,我们通过RNAi技术抑制了Sl NAC4基因在番茄中的表达,转基因果实表现出抑制的果实成熟表型、叶绿素降解受阻、果实成熟时间延迟、乙烯合成量减少(主要是因为乙烯合成相关基因的表达被下调)以及类胡萝卜素积累降低(主要是因为类胡萝卜素合成途径受影响)。同时,转基因番茄果实中多个成熟相关基因的表达也表现出显著的下调。这些结果表明Sl NAC4蛋白是作为正调控因子,通过影响乙烯的合成和类胡萝卜素的积累从而参与调控番茄果实的成熟过程。此外,我们发现Sl NAC4基因的表达不受乙烯的诱导,且在成熟调控因子RIN的上游位点正调控其表达。酵母双杂交实验还表明,Sl NAC4蛋白可分别与NOR及RIN蛋白相互作用。这些结果表明,Sl NAC4蛋白能通过依赖于乙烯和不依赖于乙烯的信号途径在果实成熟调控网络中影响果实的成熟过程。另外,考虑到Sl NAC4基因的表达受盐和脱水胁迫的显著诱导,且Sl NAC4-RNAi转基因果实中乙烯合成量减少,而乙烯已被证实在植物胁迫响应中也扮演着重要角色,暗示Sl NAC4基因可能在非胁迫响应中也具有一定的功能。为了验证这一功能,我们比较了盐和干旱胁迫对WT和Sl NAC4-RNAi转基因植株生长的影响。结果表明,在发芽后幼苗生长阶段,转基因植株根和芽的生长受盐胁迫的抑制比WT番茄植株更为明显。叶子的盐水侵泡实验表明,与WT相比,转基因植株含有更低的叶绿素含量,说明Sl NAC4-RNAi转基因植株的盐耐受性较差。此外,Sl NAC4-RNAi转基因植株在土壤中的盐和干旱胁迫耐受性也变差,主要表现为胁迫条件下转基因植株含有更低水平的叶绿素和相对含水量,且叶片的失水速率更快。我们还发现,在正常和盐胁迫情况下,Sl NAC4-RNAi转基因植株中多个胁迫相关基因的表达水平均出现下调。这些结果表明Sl NAC4蛋白是作为正调控因子在非生物胁迫响应中发挥重要作用,其在今后改良番茄盐和干旱胁迫耐受性中具有一定的应用价值。总之,Sl NAC4基因不仅可通过调控乙烯的生物合成和类胡萝卜素积累来参与调控番茄果实的成熟过程,同时Sl NAC4基因在番茄非生物胁迫响应中也发挥重要作用。目前,DEAD-box解旋酶被证实参与花、种子以及根等的发育,而其在植物胁迫响应方面的功能研究还处于起步阶段。尽管大量的DEAD-box RNA解旋酶基因在植物中已被鉴定,但是有关植物中DEAD-box RNA解旋酶参与胁迫响应的相关报道依然有限,且多集中在模式植物拟南芥中,而它们发挥功能的具体机制也依然不清楚。目前,有关番茄中DEAD-box RNA解旋酶基因的具体功能研究依然未见报道。本研究中,经过筛选,我们鉴定了两个番茄DEAD-box RNA解旋酶基因,随后它们分别被命名为Sl DEAD30和Sl DEAD31。组织表达模式分析表明,Sl DEAD30基因在根和成熟叶中的表达相对较高,而在其他组织中的表达较弱。Sl DEAD31基因则在番茄所有检测的组织中几乎恒量表达。进化树分析表明Sl DEAD30和Sl DEAD31均属于胁迫相关的DEAD-box RNA解旋酶蛋白。另外,番茄Sl DEAD30和Sl DEAD31基因的表达受多种非生物胁迫的诱导,包括Na Cl、脱水、高温和低温等。Sl DEAD30基因的表达未受所处理激素的明显诱导,而Sl DEAD31基因的表达则受Me JA的诱导。此外,我们通过超表达和沉默以进一步研究Sl DEAD31基因的功能。我们发现,Sl DEAD31基因的沉默可能是致死的,而Sl DEAD31基因的超表达并不能明显影响番茄果实的正常发育与成熟。随后,我们继续探索其在番茄盐和干旱胁迫中的可能功能。结果表明,Sl DEAD31超表达转基因番茄植株在发芽后幼苗生长阶段中表现出增强的盐耐受性。此外,超表达植株在土壤中也表现出显著增强的盐胁迫耐受性,但对干旱胁迫耐受性的增强不是很明显,主要表现为:与WT植株相比,转基因植株中多个生物和非生物胁迫相关基因的表达显著上调,以及更高的存活率、相对含水量和叶绿素含量,更低的丙二醛含量和水分损失速率。这些结果表明我们初步在番茄中鉴定了Sl DEAD30和Sl DEAD31基因,并证实Sl DEAD31蛋白作为正调控因子在番茄非生物胁迫响应中发挥重要作用,为今后通过调控“DNA/RNA解旋”的方式提高植物抵御环境胁迫的能力奠定了基础。综上所述,本研究从番茄中分别筛选出七个NAC转录因子家族基因和两个DEAD-box RN A解旋酶基因,并对Sl NAC4和Sl DEAD31基因在番茄果实成熟和非生物胁迫响应中的功能和机制进行了初步探索和分析,对全面阐明Sl NAC4和Sl DEAD31基因在植物中的功能和机理以及日后它们可能在基因工程中的应用奠定了基础。


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