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番茄Sly-miR403的分离鉴定及在番茄发育过程中的功能研究

张超  
【摘要】:micro RNA(miRNA)是一类保守的、长度为19~24个碱基的小分子非编码RNA。在植物中,miRNA通过对靶基因进行剪切、抑制蛋白翻译因子对靶基因的识别或对靶基因的基因组进行甲基化等,从而在转录或转录后水平特异调控靶基因的表达。miRNA合成及作用途径中的重要因子,如AGO蛋白、DCL1及HEN1等在植物的发育过程中发挥着重要的作用。AGO2是RNA Induced silencing complex(RISC)的核心元件之一,有研究报道AGO2为miR403的靶基因;然而,在重要的果实模式生物——番茄中,AGO2与miR403的生理功能尚不明确。因此,为了阐明番茄miR403的生理功能,以micro-Tom番茄为研究对象,利用生物信息学方法和分子生物学技术,获得并验证番茄miR403序列,通过现代生物技术手段构建表达载体、遗传转化获得miR403超表达和缺失表达的转基因植株,观察其表型并对其靶基因进行分析,得到如下主要研究结果:1.通过拟南芥miR403(MI0001072)成熟序列在番茄siRNA数据库进行blast比对,找出潜在的番茄miR403(S14362631);通过在番茄基因组数据库中进行低阈值对比,找出与番茄miR403匹配的基因组位点,其所在位置即为miR403的潜在前体序列;通过RNA结构软件分析,确定其是能够形成完整茎环结构的Sly-miR403前体序列;2.用番茄miR403成熟序列对比,找出潜在靶基因AGO2,采用5’RACE mapping技术检测AGO2的匹配位点,证实Sly-miR403在番茄中可发挥作用,能有效剪切AGO2基因的mRNA;同时用定量PCR检测Sly-miR403及其靶基因在番茄中的表达模式,验证成熟序列的正确性并分析其在番茄生长发育中潜在的作用;3.根据获得的Sly-pre-miR403序列,设计基因特异性引物,对Sly-pre-miR403进行扩增,并克隆到植物表达载体p Bi121上,命名为pBi121-miR403;根据Sly-miR403的成熟序列,设计miR403-sponge片段,合成后构建到pBi121上,命名为pBi121-miR403-sponge载体;将pBi121-miR403、pBi121-miR403-sponge用冻融法转入农杆菌C58中,并用叶盘法转入野生型番茄,获得其转基因植株;4.通过观察转基因植株的表型并分析发现,pBi121-miR403超表达的转基因植株出现开花延迟、叶片异常、种子发芽过程中对ABA的抗性及顶端分生异常的现象;5.检测靶基因在转基因及非转基因植株中的表达变化,明确miR403超表达后降低其靶标基因SlAGO2的丰度,同时提高SlAGO1A/SlAGO1B的丰度,从而影响miR156、miR159及miR394等下游miRNA的表达,进而影响番茄的生长发育。提出了miR403/AGO2、miR168/AGO1在生长发育、病毒入侵条件下不同的平衡假设。课题以重要的果实模式生物番茄为研究材料,分离和鉴定Sly-miR403及其靶基因AGO2。研究表明,番茄miR403能有效剪切AGO2基因的mRNA,miR403超表达后降低其靶标基因SlAGO2的丰度,同时提高SlAGO1A/Sl AGO1B的丰度,影响miR156、miR159及miR394等下游miRNA的表达,进而影响番茄的生长发育。


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