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MSC胞外基质功能化纤维支架的抗异物反应研究

董立立  
【摘要】:目前,先进的植入性生物材料和组织工程技术有望改善甚至恢复缺损或病变器官的生物学功能。然而,在临床实践中仍然面临着材料-宿主功能整合的组织相容性问题。生物材料植入引起的异体反应(Foreign-Body Response,FBR)导致植入材料表面的纤维化和胶原纤维囊的形成,并伴有慢性炎症、组织纤维化、组织粘连、以及疤痕形成等临床问题,严重阻碍了植入物的长期功能保持与稳定。随着对生物材料植入后发生的一系列细胞和分子事件的深入理解,研究者发现,巨噬细胞作为先天性免疫和获得性免疫的共同参与者,其高度的功能可塑性在调节植入物的异物反应、组织-材料功能整合以及组织修复与再生中起到了关键作用。因此,研究人员开发了一系列基于调控巨噬细胞行为的设计策略来降低异物反应程度。这些修饰策略(包括物理改性、化学修饰以及生物活性分子的释放)在一定程度上缓解了植入物的FBR并改善了其与宿主的功能整合,但仍缺乏具有改善局部免疫微环境的“免疫再生”生物材料。因此,开发抵抗FBR的新型“免疫调节”生物材料依然是生物医学领域的重要挑战。如果从“向自然学习”的角度出发,经内源性“免疫调节剂”修饰的材料在体内和体外指导免疫反应的性能可能更加稳定。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)强大的免疫调节能力(特别是在炎症介质刺激下所获得的免疫调节特性)为我们设计新型“免疫调节”生物材料提供了启发。随着对MSC免疫调节机制的深入理解,研究者普遍认为MSC主要通过旁分泌机制发挥其免疫调节功能。因此,MSC衍生的细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)作为MSC旁分泌的主要产物有望应用于组织工程和再生医学。因此,我们假设炎症介质刺激下MSC衍生的ECM(i ECM)可作为一种内源性“免疫调节剂”,通过调控巨噬细胞介导的炎症反应从而降低FBR。基于以上假设,我们通过MSC-i ECM的功能化构建了一种可调控巨噬细胞行为的“免疫调节”支架材料。在体外考察了i ECM功能化支架对巨噬细胞极化及免疫功能的调控作用。此外,在体内探索了i ECM功能化支架的异物反应以及其在预防跟腱粘连中的作用。进一步,我们分析了MSC衍生ECM中的两类重要的功能性组分——生物活性因子与外泌体,它们在调控巨噬细胞的炎症应答中起到关键作用。本文的主要研究内容和结果如下:(1)MSC-ECM功能化纤维支架的构建及其免疫调控作用利用脱细胞组织工程技术构建ECM功能化电纺纤维支架。首先通过乳化静电纺丝技术制备聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)/丝素蛋白(Silk fibroin,SF)复合纤维支架作为ECM沉积的基底材料。对纤维支架的理化性质进行表征发现,PCL/SF复合纤维支架显示出微/纳米双峰纤维结构。细胞实验进一步证明,PCL/SF双峰纤维支架较大的纤维直径和孔径,促进了细胞在支架上的粘附、浸润以及分泌的ECM在支架内部的沉积。其次,利用脱细胞法构建负载MSC-ECM的PCL/SF纤维支架(PCL/SF-ECM),并通过炎症因子干扰素-γ(Interferon,IFN-γ)刺激MSC以获得具有免疫调节功能的细胞外基质(Immunomodulatory Extracellular Matrix,i ECM)。通过脱细胞有效性检测发现,本实验所采用的物理冷冻联合NH_4OH处理的脱细胞方法可有效去除细胞的免疫原性成分,同时保留大量细胞外基质成分。与此同时,纤维支架的力学性质检测发现ECM的表面功能化增强了PCL/SF纤维支架的力学强度。此外,我们探究了ECM功能化纤维支架对巨噬细胞的免疫调控作用。免疫荧光染色和实时定量PCR结果显示i ECM功能化纤维支架调控巨噬细胞表型从M1向M2极化,同时显著降低了多种炎症因子水平。总体来说,乳化电纺制备的PCL/SF双峰纤维支架的高细胞浸润性为获得更丰富的干细胞胞外基质提供了理想的培养平台。其次,利用脱细胞组织工程技术构建的ECM功能化纤维支架在体外显著降低巨噬细胞的炎症反应。(2)MSC-ECM功能化纤维支架的体内异物反应及抗跟腱粘连研究为了探究ECM功能化支架的体内异物反应及其在预防组织粘连中的作用,我们首先在体内构建了大鼠皮下移植模型。组织切片HE和Masson染色结果证明,i ECM功能化支架前期显著促进宿主细胞浸润,后期则抑制胶原纤维囊的形成。同时切片免疫荧光染色证明i ECM功能化支架通过调节巨噬细胞向M2型极化显著降低FBR。此外,利用构建的i ECM功能化纤维支架作为防粘连的物理屏障,评估其预防跟腱粘连的效果。我们在体内构建了大鼠跟腱损伤模型,分别用PCL/SF、PCL/SF-ECM和PCL/SF-i ECM支架包裹损伤部位,并于7天、14天、28天处死大鼠,进一步通过大体观察和组织学分析评估跟腱粘连情况。结果发现,i ECM功能化纤维支架由于其免疫调节功能显示出明显的抗粘连作用。此外,i ECM功能化支架组较高的血管化程度,提示该支架不仅具有优异的抗粘连作用,还可能潜在地促进肌腱再生。(3)MSC-ECM功能性组分分析为深入了解MSC-ECM发挥免疫调节作用的功能性组分,我们首先采用定量蛋白质组学技术,进行了一项大规模的胞外基质蛋白质组学研究。从ECM样品中鉴定出2402个蛋白质,这些鉴定蛋白大部分属于ECM蛋白、信号蛋白和免疫应答蛋白,占检测蛋白的69%。重要的是,我们在ECM中检测到了多种生物活性因子和受体,包括转化生长因子β诱导蛋白(TGFBI)、胰岛素生长因子2(IGF2)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生生长因子α(PDGFA)、血管内皮生长因子受体3(VGFR3)、TGF-β受体2(TGFBR2)、白介素13受体亚型α1(IL13RA1)等。这些生物活性因子在调控巨噬细胞的炎症应答中起到关键作用。其次,通过对不同条件下(2D,PCL/SF,PCL/SF+IFN-γ)MSC差异表达蛋白进行富集分析发现,与2D培养相比,PCL/SF纤维支架显著影响了MSCs的多种代谢途径,包括氨基酸代谢、糖代谢和能量代谢等。相比之下,IFN-γ刺激激活了MSC与免疫调控相关的多种信号通路,(包括趋化因子信号通路、NF-κB信号通路、B细胞/T细胞/Toll样受体信号通路、TGF-β信号通路以及补体级联等)。进一步,我们利用扫描电镜、外泌体荧光标记以及Western blot等手段鉴定了嵌入在ECM功能化支架中的外泌体,并对MSC来源外泌体的免疫调节功能进行验证。结果发现,微/纳米尺寸的胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)/外泌体存在于由脱细胞产生的ECM功能化纤维支架中,并以聚集的形式嵌入ECM中。对MSC分泌的外泌体的功能性进行验证发现,MSCs来源的外泌体显著调控巨噬细胞向抗炎的M2型极化,并且抑制巨噬细胞多种炎症因子表达。而IFN-γ预处理MSCs分泌的外泌体具有更强的免疫抑制作用。综上所述,MSC-ECM中的多种生物活性因子及外泌体,作为ECM的功能性组分在调控巨噬细胞的炎症应答中起到关键作用。这些功能性成分的鉴定为ECM功能化支架的免疫调节作用提供了机制上的见解。综上所述,本研究通过MSC-i ECM的表面功能化构建了一种调控巨噬细胞行为的新型“免疫调节”支架材料。该i ECM功能化纤维支架通过调控巨噬细胞表型从M1向M2型转化成功降低异物反应并有效预防组织粘连。以MSC-ECM为基础的组织工程支架,作为一种无细胞再生医学策略,具有重要的研究前景和临床应用价值。


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