收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

NPC1基因转染间充质干细胞促进造血干细胞增殖作用研究

旷田垠  
【摘要】:处于干细胞龛(Niche)的造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell,HSCs)具有自我更新能力以及多向分化潜能,能维持造血系统的稳定及动态平衡。HSCs常用于临床移植治疗,但不易获取、数量稀少和体外增殖困难等因素限制了这一治疗策。因此,如何有效促进HSCs的体外扩增是有待解决的关键问题。Niche中的基质细胞参与HSCs功能调节,主要途径有Wnt信号转导、Notch配体信号传导、细胞因子分泌等。间充质干细胞(Mesenchyma Stem Cell,MSCs)是经典的龛合细胞,可以为HSCs的体外自我更新和干性维持提供必需的旁分泌因子(生长因子、趋化因子、细胞因子及外泌体等)。慢病毒等基因修饰工具将外源基因转导进MSCs,能进一步提高在体外MSCs对HSCs的增殖影响。NPC1位于细胞内的溶酶体膜上,是转运胆固醇的关键蛋白。课题组前期结果显示,NPC1基因能够促进HSCs的增殖。因此,本文以慢病毒颗粒为载体,将外源NPC1转导进MSCs中并稳定表达,通过Transwell共培养,研究体外NPC1过表达的MSCs对HSCs增殖的影响。主要研究内容与结论如下:(1)慢病毒制备:构建表达NPC1基因的重组质粒,通过第三代慢病毒载体系统制备GFP-NPC1慢病毒以及空载慢病毒,并超滤提纯,分别通过流式检测、q PCR法结合滴度计算公式得出慢病毒感染活性。结果表明,成功制备出两种慢病毒,且均满足10~8TU/m L-10~9TU/m L的浓度范围,具有较强的转染能力,可用于原代细胞的转染。(2)脐带间充质干细胞的分离与鉴定:采用外植体培养法,从脐带碎片中分离出MSCs并传代至p3,分别通过流式检测表面标志物以及分化诱导进行细胞鉴定。结果表明,从人脐带分离出的hu MSCs贴壁生长呈放射状,流式细胞仪检测出高表达CD90(=100%),而低表达CD45、CD34(2%),并成功诱导出成骨与成脂细胞,所得结果满足国际细胞和基因治疗协会所定义的人间充质干细胞的三个最低标准特征。(3)脐带血造血干细胞分离与鉴定:脐带血单个核细胞用密度梯度离心法分离,再用免疫磁珠从单个核细胞分离出CD34~+细胞,并鉴定其纯度。结果表明,密度体离心以及免疫磁珠法相结合能够获得高纯度(82.4%)的CD34~+细胞。(4)慢病毒转染的MSCs与HSCs非接触Transwell共培养对HSCs细胞增殖、形态影响:具体分组情况为,HSCs组、HSCs+MSCs组、HSCs+GFP-MSCs组、HSCs+NPC1-MSCs组,培养至第五天后收集HSCs样本。经细胞计数(×10~5)与瑞氏-吉姆萨染色结果表明:HSCs+NPC1-MSCs组(1.51±0.1)均高于HSCs组(0.44±0.015)、HSCs+MSCs组(1.04±0.075)、HSCs+GFP-MSCs组(1.06±0.058),P值均小于0.01,NPC1过表达的MSCs能够显著提高HSCs的体外增殖能力,且四组HSCs形态均无明显变化。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前14条
1 中国科学院微生物研究所高福研究团队;;科研成果:埃博拉病毒糖蛋白结合内吞体受体NPC1的分子机制[J];科学与社会;2017年01期
2 叶智;雷正明;;NPC1在胆固醇平衡与胆固醇结石形成中的作用[J];西南军医;2013年02期
3 刘永梅;史红霞;李颜;马振刚;王林玲;许金山;周泽扬;党晓群;;中华蜜蜂NPC1蛋白AcNPC1的原核表达、多克隆抗体制备及功能鉴定[J];昆虫学报;2020年11期
4 李晓旭;胡炎伟;莫中成;肖继;刘协红;易光辉;危当恒;唐雅玲;唐朝克;;氧化型低密度脂蛋白经ERK1/2-COX-2途径对巨噬细胞NPC1表达的影响[J];中国动脉硬化杂志;2009年07期
5 牛俪丹;杨记超;管丽红;杜江;乔梁;刘彦礼;林俊堂;;Npc1基因突变引起脂质代谢异常从而诱导肾脏细胞凋亡并促进纤维化[J];中国病理生理杂志;2019年12期
6 李慧;杨志明;肖传实;康玉明;;血管紧张素-(1-7)与血管紧张素Ⅱ对THP-1巨噬细胞NPC1表达及胆固醇流出的影响[J];中国病理生理杂志;2011年03期
7 杨萍;张汉斌;刘钰林;方淑香;李平;许小洋;;烟酸经LXRα/NPC1途径促进巨噬细胞溶酶体胆固醇外流[J];中国病理生理杂志;2020年08期
8 Xin Gong;Hongwu Qian;Xinhui Zhou;Jianping Wu;Tao Wan;Pingping Cao;Weiyun Huang;Xin Zhao;Xudong Wang;Peiyi Wang;Yi Shi;George F.Gao;周强;颜宁;;NPC1蛋白介导胆固醇转运和埃博拉病毒入侵的结构基础[J];科学新闻;2017年04期
9 欧翔;代小艳;龙治峰;唐雅玲;曹冬黎;郝新瑞;胡炎伟;李晓旭;唐朝克;;肝X受体激动剂通过上调NPC1基因的表达减轻apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化病变程度[J];中国科学(C辑:生命科学);2008年04期
10 赵玄女,徐亮,冯明业,姚雪彪;NPC蛋白研究进展[J];济宁师范专科学校学报;2004年06期
11 张莉;张旻;姜亚平;卜碧涛;郝又国;;Rab7与NPC1在小胶质细胞及小鼠小脑普肯耶细胞的定位[J];神经损伤与功能重建;2009年05期
12 杨忠伟;冯秀丽;范新平;曹旭东;;二尼曼匹克病家系NPC1和NPC2基因突变检测分析[J];实用医学杂志;2013年04期
13 郝又国;王家泉;张旻;徐金枝;卜碧涛;王雪贞;张莉;;Rab9与NPC1在小胶质细胞内的定位研究[J];神经损伤与功能重建;2009年01期
14 李晓旭;唐朝克;;ABCA1与NPC1在细胞内胆固醇转运中的作用[J];生命的化学;2008年05期
中国重要会议论文全文数据库 前4条
1 孙婧;杨威;张学;;一例尼曼匹克C型疾病NPC1基因的新突变[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年
2 倪旺;吴志英;;携带NPC1基因突变的尼曼-皮克病C型一家系分析[A];中华医学会第十七次全国神经病学学术会议论文汇编(上)[C];2014年
3 李慧;杨志明;肖传实;康玉明;;血管紧张素-(1-7)与血管紧张素Ⅱ对THP-1巨噬细胞NPC1表达[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年
4 李慧;杨志明;肖传实;康玉明;;血管紧张素Ⅱ通过下调THP-1源性巨噬细胞NPC1的表达而减少细胞[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 杨雪钧;炎症干扰NPC1介导的胆固醇稳态平衡在原发性肾病综合征发生发展中的分子机制[D];重庆医科大学;2019年
2 李国利;NPC1调控的胆固醇运输稳态在病毒复制中的作用及机制研究[D];河南农业大学;2021年
3 郭拥军;NPC1在细胞内胆固醇代谢SREBP信号通路中的作用探讨[D];山东大学;2007年
4 邹云丁;NAT2基因多态性与AML遗传易感性研究和NPC1与经典wnt信号通路的相互作用[D];第三军医大学;2017年
中国硕士学位论文全文数据库 前8条
1 旷田垠;NPC1基因转染间充质干细胞促进造血干细胞增殖作用研究[D];重庆大学;2021年
2 周吉;胡椒碱对肥胖和糖尿病小鼠肠漏及肠道菌群的调控及Npc1基因缺失对肥胖小鼠胰岛功能的影响[D];青岛大学;2021年
3 曹胜西;斑马鱼三维质谱成像方法的建立及应用于NPC1疾病的研究[D];广东工业大学;2021年
4 李慧;血管紧张素-(1-7)与血管紧张素Ⅱ对巨噬细胞NPC1表达及胆固醇外流的影响[D];山西医科大学;2011年
5 熊晓;炎症状态下高脂通过NPC1介导内质网应激致足细胞损伤机制研究[D];重庆医科大学;2016年
6 党永龙;四个中国黄牛品种NPC1与NPC2基因遗传变异及其表达规律研究[D];西北农林科技大学;2015年
7 叶智;NPC1及SREBP2表达情况与胆固醇结石致石胆汁的关系研究[D];泸州医学院;2013年
8 欧翔;肝X受体激动剂上调apoE基因敲除小鼠NPC1和NPC2的表达[D];南华大学;2007年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 记者 彭科峰;科学家首次解析NPC1蛋白结构[N];中国科学报;2016年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978