应力对植物生长行为的影响及其相关基因的表达

【摘要】：植物与环境是相互作用不可分割的统一体,两者相互依赖,相互影响。环境因子对植物生长的影响是植物生理学和生物物理学中的一个热点。但是关于植物是如何响应应力刺激的,应力信号又是如何引起植物基因的表达的研究极其有限。为了在理论上进一步深入了解应力对植物生长的作用,在应用上为植物新品种的培育及品种改良寻求一种新的方法,本文以声波刺激为加载方式,从植物的苗、细胞和组织三个层次,对应力对植物生长的作用进行了初步的探索,并从基因水平上分析了应力刺激下植物基因的表达。本论文的具体研究工作和结论如下: 首先,本文研究了声波影响植物苗生长的基本规律。结果表明:当声波频率为1000Hz、强度为100dB时对苗的生长有明显的促进作用;而当声波频率和强度超过一定值时,则对苗的生长有抑制作用。通过考察声波对植物的光合和呼吸作用,发现声波对植物正常的光合、呼吸等功能并无明显的影响。这说明声波对植物生长的影响不是通过影响其呼吸和光合作用来实现的。然后我们测定了根系活力、可溶性糖和蛋白的含量变化。结果表明:刺激组根系活力、可溶性糖和蛋白含量要明显高于对照组。说明适宜的声波刺激强度对植物生长的促进作用是通过增强根的活力,提高根系对营养元素的吸收利用来实现的。检测声波刺激对植物体内保护酶活性的影响后发现,不同刺激周期的声波均使菊花的超氧化物歧化酶(SOD),过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)即保护酶系统活性增强,并且在刺激9天时,活性较其他组更高。此外,在部分实验组的培养基中加入不同浓度的蛋白质合成抑制剂环己亚胺酮(CHM)后发现,POD和CAT的活性有所降低,暗示着声波处理使保护酶活性升高的原因可能是声波处理促进了细胞内酶的合成。 其次,本文研究了声波刺激对植物愈伤组织生长的影响,并重点考察了内源激素IAA和ABA的含量变化。和对照组相比,在愈伤组织生长及再分化期间,刺激组中IAA 的含量显著增加,ABA的含量有所降低。这种变化可能是声波刺激强化了愈伤组织的生理机能,使愈伤组织中激素含量增加,也可能是植物对声波刺激的一种特异响应。 同时,我们也对在声波刺激下对细胞质膜的影响进行了研究。结果表明:声波刺激使标记质膜的DPH荧光偏振值降低,而C540荧光强度增加。这说明一定强度和频率的声波刺激使质膜变得疏松,膜表面电荷密度和质膜疏水性降低,膜的流动性增加。用红外光谱方法测定了声波刺激对质膜蛋白酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的影响。实验结果表明,声波刺激对质膜蛋白的α螺旋影响相对较小,其特征谱带 WP=6 变化在5cm-1以下;而对酰胺Ⅱ带的β折叠影响较大,其波数增大10cm-1左右。表明声波刺激对质膜蛋白二级结构产生了影响。对声波刺激下菊花细胞H+-ATPase的活性调控的研究表明,细胞质膜H+-ATPase活性显著升高。我们发现H+-ATPase活性对培养基中的Ca2+的浓度敏感,并且在培养基中加入质膜钙离子通道抑制剂异博定(Veraparimal)可对H+-ATPase活性有抑制作用;而加入钙离子载体A23187,则可恢复这种抑制作用。同时,如果在培养基中添加蛋白激酶抑制剂星孢霉素,H+-ATPase活性则不被激活。这些实验结果说明,H+-ATPase在声波刺激下其活性的调控可能是通过可逆磷酸化模式进行的。 最后,我们对声波刺激下菊花特异性基因的表达进行了检测和分析。结果表明:声波处理组菊花的总RNA得率要明显高于对照组的总RNA得率。用提取的刺激组和对照组总RNA为模板,运用mRNA逆转录差异显示技术(DDRT-PCR)筛选受声波诱导的差异表达基因片段,在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离得到八个差异片段,分别为SA5-1、SA5-2、SA7、CA7、SC1、SC8-1、SC8-2、CG1。对上述八个差异片段重扩增后,在琼脂糖凝胶上显示的结果表明,八个片段中只有SA5-2、SC1和SC8-1三个片段的分子量和变性聚丙烯酰胺凝胶上显示的分子量一致。为了进一步确定SA5-2、SC1和SC8-1是否为真正受声波诱导而表达的条带,对其进行了Northern点杂交。检测结果显示SC8-1 为特异性表达条带,SA5-2为优势表达条带,SC1为声波抑制表达条带。表明声波刺激引起了植物细胞相关基因的表达。