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昆虫病原真菌绿僵菌二糖水解酶研究

李艳玲  
【摘要】:金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在昆虫防治中起着重要作用。与化学农药相比,尽管真菌杀虫剂安全,无环境污染,但却存在着杀虫速率缓慢的弱点,这在很大程度上阻碍了真菌杀虫剂的应用。昆虫病原真菌致病机制的研究可为发展新型高效真菌杀虫剂提供依据。真菌突破昆虫表皮障碍侵入寄主血淋巴后会产生一系列的二糖水解酶,其中包括海藻糖水解酶。海藻糖水解酶能有效地降解昆虫血淋巴中的海藻糖,在真菌对昆虫的致病过程中起着重要的作用。 本文对金龟子绿僵菌黄变种CQMa102侵染的东亚飞蝗血淋巴中各种二糖含量变化,CQMa102产二糖水解酶培养条件以及二糖水解酶同工酶进行了系统研究,为进一步纯化二糖水解酶的主要同工酶、分离其毒力基因,利用基因工程手段改造病原真菌以提高生物防治效果奠定了基础。 主要研究结果如下: 1. 利用数码显微镜观察了CQMa102侵染东亚飞蝗的过程。在接种绿僵菌1和2天的蝗虫血淋巴中未发现虫菌体。在感染3天时,东亚飞蝗血淋巴中开始出现虫菌体,到了第4天时,虫菌体数量大大增加,而此时蝗虫血细胞的数目明显减少。 2. 测定了东亚飞蝗感染CQMa102后血淋巴中二糖及二糖水解酶的含量。研究结果表明:东亚飞蝗成虫感染CQMa102后,血淋巴中海藻糖含量显著降低,而海藻糖水解酶活性相应升高,但是血淋巴中葡萄糖含量并未升高;麦芽糖含量在感染组蝗虫中含量也有所下降,其相应的麦芽糖水解酶活性在感染后也有一定程度的升高。 3. 利用产物(葡萄糖)测定法测定了CQMa102二糖水解酶活性,初步筛选出适于CQMa102产酶的培养基和培养条件。 适于CQMa102产海藻糖水解酶的培养基为:1.0g/L KH2PO4,0.5g/L MgSO4,1.0g/L KCl,10g/L可溶性淀粉,5g/L蛋白胨,5g/L酵母浸膏,pH值调至6.0。当把0.5ml 1.0×107个/ml CQMa102孢子悬液接种到50ml最适产酶培养基中,在26℃、150rpm的条件下振荡培养3天,海藻糖水解酶总活性可达到14.125U,比活可达到9.588U/mg。 适于CQMa102产麦芽糖水解酶的培养基为:1.0g/L KH2PO4,0.5g/L MgSO4,1.0g/L KCl,10g/L麦芽糖,5g/L蛋白胨,5g/L酵母浸膏,pH值调至6.0。当把0.5ml WP=5 1.0×107个/ml CQMa102孢子悬液接种到最适产酶培养基中,在26℃、150rpm的条件下振荡培养3天,麦芽糖水解酶总活性可达到12.051U,比活可达到7.749U/mg。 4. 通过比较CQMa102菌丝提取液和滤液中二糖水解酶的活性,确定了二糖水解酶在真菌细胞中的位置。结果表明:CQMa102海藻糖水解酶和麦芽糖水解酶都是分泌性蛋白,主要分泌到培养基中,很少结合在细胞壁上。 5. 利用等电聚焦电泳(IEF)对CQMa102不同碳氮源培养液和感染组蝗虫血淋巴进行了二糖水解酶同工酶分析,确定了与感染相关的同工酶带。 以海藻糖为底物,分别以可溶性淀粉和山梨醇作为唯一碳源,CQMa102产生两种同工酶,pI值分别为8.4和5.4;以葡萄糖和麦芽糖作为唯一碳源,CQMa102产生一种pI值为8.4的同工酶;而以海藻糖作为唯一碳源时,CQMa102产生一种pI值为5.4同工酶。当以有机氮为氮源时,CQMa102在淀粉培养基上产生两种同工酶,pI值分别为8.4和5.4,而以硫酸铵作为唯一氮源时,CQMa102也产生两种同工酶,pI值分别为6.7和5.4。东亚飞蝗感染CQMa102后血淋巴中出现了一种pI值为5.4的同工酶,初步确定此同工酶可能与感染有关。 以麦芽糖为底物,分别以麦芽糖、蔗糖和可溶性淀粉作为唯一碳源时,CQMa102都产生两种同工酶,pI值分别为8.4和7.0,而以葡萄糖和山梨醇作为唯一碳源时,CQMa102只产生一种同工酶,前者pI值为8.4,后者为7.0。东亚飞蝗感染CQMa102后血淋巴中出现了一种pI值为5.0的同工酶,此同工酶在CQMa102体外培养液中未被发现。


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