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贡嘎蝠蛾幼虫肠道细菌多样性分析

卓凤萍  
【摘要】:贡嘎蝠蛾(Hepialus gonggaensis)幼虫是名贵中药材冬虫夏草(Cordyceps sinensis)的优势寄主之一。人工培植中幼虫抗逆力弱,易受微生物感染,是影响冬虫夏草资源保护和开发的重要制约因子。研究贡嘎蝠蛾幼虫肠道菌群多样性,对于研究其营养生理,进而改善和研制人工饲料,提高幼虫抗逆力和成活率有重要意义。 本研究以四川康定雅家埂山上采集的贡嘎蝠蛾为实验材料,按传统的培养分离方法对贡嘎蝠蛾幼虫的肠道细菌进行分离和鉴定。实验结果表明,贡嘎蝠蛾肠道细菌都属低温菌,最适生长温度15℃,在15℃培养2d 后才长出典型菌落。从肠道中分离纯化出12 个不同菌群,其中优势菌群为葡萄球菌(Staphylococcus ),菌群数量为2.05×109mL-1,检出率100%,应为幼虫肠道中的常住菌群,其它菌群检出率均低于50%,可能为肠道中的过路菌群。生化鉴定大多数菌群的符合值都较低,这与蝠蛾生活于高海拔高寒地区,其肠道微生物与常见微生物菌群有较大差异一致。 利用分子生物学方法研究了贡嘎蝠蛾幼虫肠道细菌多样性。研究用根据大肠杆菌16SrRNA 基因保守序列设计的引物对贡嘎蝠蛾幼虫肠道基因组DNA 进行PCR 扩增,再利用变性梯度凝胶电泳对扩增得到的16SrDNA 序列进行直观分离。采用变性剂浓度范围为10%-60%时,分离得到12 条带,进一步缩小变性剂范围为25%-48%,最终分离得到76 条带。因为每个条带很可能就代表一个不同的微生物物种,所以DGGE 带谱中条带的数量和亮度,即可相应反映出该环境中微生物种类的数量及群落中的优势菌群。从实验结果可以看出,贡嘎蝠蛾幼虫肠道中存在着大量细菌,它们的种类和数量各不相同,即贡嘎蝠蛾幼虫肠道中具有丰富的细菌多样性。多次重复地从健康贡嘎蝠蛾幼虫体内取得肠道富集后,应用DGGE 技术进行研究,都可以得出比较一致的结果。由此可见,以DGGE 技术分离16SrDNA条带研究昆虫肠道细菌多样性是可行的。 把DGGE 分离得到的最亮的8 条带进行纯化,克隆和测序,并对所得序列以分子信息技术进行BLAST 比对,结果表明:除3 条带外,其他条带的顺序与已知菌株的顺序都有较大的差异,暗示这些条带所代表的菌株可能尚未被人们获得并研究过,因此采用此方法对贡嘎蝠蛾幼虫肠道微生物进行研究将是可行的。 在DGGE 与纯培养的比较研究中,两种方法检测到的细菌多样性结果不完全一致,说明每种方法都有一定的选择性和局限性,得到纯培养的物种并不一定是肠道环境中的真正的优势类群,它们或许只占环境中细菌总数的一小部分。


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