声波刺激对铁皮石斛生长代谢的影响及其相关基因表达和克隆研究

【摘要】： 随着Bio+X学科的兴起,物理学与植物学的交叉与融合已受到国内外学术界的关注。国内外学者研究发现:人为机械力加载对植物细胞的生长、分裂具有显著的调控作用,且在适度的应力加载下植物细胞均优先性垂直于应力矢量的伸长生长。然而,对于植物细胞的机械力信号感受、信号转导机制的理解,以及物理应力对药用植物的生长代谢及分子表达调控有何影响等方面,目前的研究工作都只是提供了零星的实验结果,尚无系统、完整的途径解释。 本课题以珍贵的药用植物铁皮石斛为研究对象,基于已有的工作基础及研究方法,利用声波加载、生化检测、基因筛选克隆、和功能基因的生物信息学预测等多学科的研究手段和先进方法,研究声波刺激干预植物的生长代谢相关的抗氧化酶系统、代谢产物的含量变化、相关酶基因片段的扩增与表达、特异表达基因的筛选克隆及其生物信息学功能预测,实验结果为揭示物理应力对植物生长代谢调控机制提供基础依据和直接的分子生物学证据,为药用植物代谢产物的提高作新方法的尝试,为寻找声波刺激下植物特异表达的功能基因和功能蛋白作前期工作。本实验取得的研究结果如下: 1.声波刺激对铁皮石斛生长的影响:研究发现,适当的声波刺激(频率1000Hz、声强100dB)对铁皮石斛组培苗的生长起明显的促进作用,超出一定范围时对其生长有抑制作用,这与本实验室在菊花和拟南芥等模式植物中的研究结果相一致。但在测定声波刺激对铁皮石斛叶、茎、根等不同生长器官的抗氧化性酶活性的影响时又发现,在声波刺激下,铁皮石斛抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、超氧歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)等几种主要抗氧化酶的活性普遍得到提高,如叶、茎和根中的APX活性平均提高了15.7%、29.5%和21.5%,CAT活性分别提高了12.3%、8.5%和26.6%;这也显示,不同的抗氧化酶响应声波刺激的形式都有所差别。同一种酶,对声波刺激的响应在不同生长器官中的差别也较大,如茎的POD活性比根的对声波刺激要敏感,SOD活性根比茎叶反应要迟钝。结果说明,声波刺激植物组培苗可能造成植物细胞活性氧(AOS)迸发,以刺激植物细胞增殖,促进植物生长。推测AOS在应力信号传递的过程中,可能是一种重要的信号分子。 2.声波刺激对铁皮石斛代谢产物含量的影响:在声波刺激下,铁皮石斛多糖含量提高较为显著,刺激组含量均高于对照组,平均提高了8.8%;总生物碱的含量提高了0.022%;可溶性蛋白质含量平均增加了14.4%,其变化呈现逐渐升高后逐渐降低的趋势;脯氨酸的含量变化呈现波浪态势,差异不很显著;丙二醛含量刺激组较对照组降低了4.9%。结果表明,声波刺激对铁皮石斛的代谢产物影响比较显著,有利于铁皮石斛多糖的积累,刺激了可溶性蛋白质含量的提高;声波刺激很可能改善了代谢产物关键酶活性,促进或抑制相关代谢产物的含量,从而使植物适应应力刺激。 3.声波刺激对铁皮石斛POD同工酶基因表达的影响:声波刺激没有诱导出新的酶带,分子杂交结果与酶谱学一致。就整体而言,声波刺激在一定的时间内能够增强植物POD基因表达,但对某一具体POD基因是起促进作用还是起抑制作用需要具体分析。 4.特异表达基因的筛选、克隆和测序:应用mRNA差异显示(DDRT-PCR)、PAGE电泳、银染和反式Northern点杂交的技术对响应声波刺激的差异表达基因片段进行了筛选、克隆和测序。在声波刺激下,铁皮石斛组培苗刺激组较对照组总RNA含量提高了3%;共筛选到4条差异性和重复性较好的基因片段,分别为:SA8、SA5、SG6和CC7。杂交结果显示,SA8为声波刺激诱导优势表达条带,SA5和SG6为声波刺激诱导性特异表达条带,CC7为声波刺激抑制性表达条带。4个基因克隆片段长分别为:Clone-SA8,552bp;Clone-SA5,390bp;Clone-SG6,408bp;Clone-CC7,496bp。 5.克隆片段的核苷酸序列分析:①Clone-SA8基因片段中的18-527核苷酸编码169个氨基酸,包含起始密码子ATG和终止子密码子TAA,可认为是一条较短的全多肽序列;通过Blastp程序在GenBank中搜索蛋白质相似性发现,Clone-SA8蛋白与多种动物的细胞分裂周期蛋白相关蛋白有较高的相似性;在与植物蛋白的序列比对中,发现与莲属植物(Lotus corniculatus var. japonicus)的细胞周期开关蛋白(cell cycle switch protein CCS52A,GenBank登录号为AAY58271.1)在氨基酸水平上具有31%的一致性,50%的相似性;与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的Srw1类似蛋白(Srw1-like protein,GenBank登录号为CAB44330.1和CAB78235.1)在氨基酸水平上具有31%的一致性,46%的相似性。②C lone-SA5基因序列与多种植物的α-微管蛋白(alpha-tubulin)基因家族中的有些基因的部分序列具有很高的相似性,其基因片段中的96-390核苷酸编码98个氨基酸,包含起始密码子ATG,但没有发现终止子密码子。③C lone-SG6基因序列与多种植物的质膜H+-ATPase酶基因家族中的有些基因的部分序列具有很高的相似性,其基因片段中的4-408核苷酸编码136个氨基酸,包含起始密码子ATG,没有发现终止子密码子。④Clone-CC7基因序列未检索到有同源性。 6.克隆片段的氨基酸序列分析及功能预测:①多序列比对分析显示,铁皮石斛Clone-SA5基因和Clone-SG6基因在进化上都非常保守,与很多物种有高度的相似性。②铁皮石斛Clone-SA8序列与L. corniculatus var. japonicus CCS52A和拟南芥Srw1-like分别进行的双重对比显示,它们的相似度不是很强,局部形似性较高,但中间都有断裂。Clone-SA8蛋白含有14个可能的结构区域或功能区域,分属5个功能类型,分子量为18.932KD ,理论等电点pI为9.67 ,化学方程式为C810H1313N253O265S3,半衰期为30 hours,不稳定指数68.49,脂肪族指数62.90,总平均疏水性-1.070,表明Clone-SA8蛋白为亲水蛋白;其二级结构是混合型的,主要由α-螺旋和环状或转角组成;没有发现信号肽,说明该蛋白不是分泌型蛋白;没有发现跨膜区域存在;没有预测出合适的卷曲螺旋;有6个超过阈值的糖基化位点。 最后,对应力与植物生长代谢和基因表达问题进行了初步的探讨。声波作为一种交变应力,对植物生长代谢和基因表达有显著的影响。本实验所选择的声波模式是一种对铁皮石斛生长代谢起促进作用的应力模式;通过剪切力、声流现象、能量转换等物理学效应增强细胞膜的通透性,加速物质的流动,改变相关酶的活性和代谢物的浓度,并通过促进或抑制相关基因的启动与表达程度来调控植物体的相关代谢途径。植物就是通过这一系列生理生化过程的变化来适应环境应力的改变。